基因检测的国际金标准是什么

基因检测的国际金标准是什么

sanger测序是基因检测国际金标准。

sanger测序概念

分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。

sanger测序原理

利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH 末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP 和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

sanger测序为什么是目前基因检测国际金标准

sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，必须要有sanger测序验证数据予以支持。

sanger测序之所以是目前基因检测的国际金标准，是因为sanger测序原理非常科学，过程非常缜密，结果真实可视，准确率非常高，达到99.999%。不需要建库，属于直接测序，直接读取结果，连续读取数据（不是一个点），不需要推导结论，过程明朗数据支撑充分。这项技术是虽然经过了38年，但应用仍然广泛，还是测序的主力军，好多检测其他方法不能替代，她金标准的地位几十年内很难替代。

精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低

1、由于没有建库环节，所以微量样品不会任意扩大，从而产生假阳性结果（与二代测序比）；

2、sanger测序首先要做PCR有限扩增，然后切胶回收主带，此过程不容易污染，即使有少量污染扩增

出的杂带，切胶回收可以有效分离，切胶回收后，电泳前要用特异性单引物测序PCR反应一次，等于又筛选了一次，所以sanger测序这种方法非常精准，非常不容易污染。

3、sanger测序是建立在目的基因精确物理定位基础上的测序（得到的结果是连续的、可视的、真实的长片段，所以出来的数据不会张冠李戴，即使读错了结果，也可以从读取的峰图序列中判出（与荧光定量PCR Taqman 探针法、普通PCR法、质谱法、芯片法、二代测序法等方法比）；

4、基因突变可分为碱基置换、颠换、缺失和插入4种，sanger测序法对于任何一种突变都可以清楚读出，而无需提前预测、预置模版造成误断结果。（与荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、质谱法等方法比）；

5、分子生物学实验是微观实验影响因素众多，由于样品和操作的差异，实验经常会出现失败，而做不出数据现象（这个概率至少是10—20%左右，其他测序方法判断是阴性结果，这样结果用于临床是否有点可怕？），而用sanger测序法检测，如果琼脂糖凝胶电泳之前和电泳过程中，任何工序不理想，都无法进行下一道工序，也就无法拿到序列峰图，这种情况必须重新实验，这种情况sanger测序绝不会当阴性结果出具报告。（与荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法比）。

sanger测序的应用领域

1、应用于医学测序、健康管理和基因潜力开发的精准检测：

将待检测DNA样本的某一个片段的碱基逐一精确检测，然后与已知的标准样本序列比较，寻找突变，发现突变与疾病（或能力、特点）的关系。包括单基因遗传病检测、易感基因精确筛查、健康能力基因检测、个性化用药精确检测、血液和器官配型基因检测、天赋基因检测、个性特质、性格特点基因检测等。

目前该技术已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。如p53基因、BRCA基因、APC 基因的检测分析，可用于早期发现某些肿瘤的易感人群，如：乳腺癌、结肠癌，对这些人群采取必要的生活方式调整、早期诊断及其它干预措施，从而达到预防医学治未病的效果。Sanger 测序可以助力癌症病人个性化用药，应用Sanger测序法对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测，结果直观、可靠，例如：K-ras基因、C-kit基因、EGFR基因序列的突变检测分析，应该是判断肿瘤患者靶向治疗的有效人群，必不可少的检测项目，例如：非小细胞肺癌，靶向药吉非替尼（易瑞沙）/厄洛替尼（特罗凯）/埃克替尼（凯美纳），用药前需检测EGFR突变，西妥昔单（爱必妥）/帕尼单抗（维克替比），用药前需检测K-ras突变，EGFR突变情况。

Sanger 测序检测不同个体细胞色素P450耐药性基因，可以确定不同人对药物的敏感性和耐受程度，是个人用药剂量确定的重要依据。

国外，Sanger测序技术在临床方面的应用主要有两个途径，即商业化检测试剂盒的应用和CAP认证独立实验室进行相关项目的检测，例如：HIV耐药突变检测试剂盒的商业化。在美国，医学独立实验室必须具有CAP(College of Ameican Pathologists，美国临床实验室／病理学家学会)认证资质，其在法律上是独立的经济实体，有资格进行独立经济核算并承担相应法律责任，在管理体制上独立于医疗机构，能立场公正地提供第三方医学检验，实验室本身对出具的检验报告负责。

发达国家Sanger测序技术已广泛应用于临床相关诊断和治疗中。Sanger测序在我国临床应用较少。2、为二代和芯片测序验证：

二代和芯片测序结果，需要sanger测序验证，因为新一代测序结果是建立在建库、推论、推理的基础上的一种测序，属于间接测序，没有过程数据支撑只有结果，受外部条件限制和程序工作人员操作影响较大，所以出来的数据有点看不见摸不着、不知对错的感觉，所以sanger测序验证是必须的环节。

3、应用于细菌、真菌鉴定：

精确确定细菌、真菌、病毒种属，为微生物开发利用或杀灭提供依据，广泛用于食用菌和益生菌开发利用（例如：食用菌品种开发改良、发酵工业、植物品种改良、石油地矿勘探等），解决饮料、食品、医药、酒类、包装等行业菌污染问题。用sanger测序，在临床上通过16SrDNA等基因定序，实现各种感染性疾病