极端微生物研究进展

极端微生物研究进展

作者：赵春杰， 吕耀龙， 马玉玲， ZHAO Chun-jie， LV Yao-long， MA Yu-ling

作者单位：内蒙古农业大学职业技术学院食品系,土右旗,014109

刊名：

内蒙古农业大学学报（自然科学版）

英文刊名：JOURNAL OF INNER MONGOLIA AGRICULTURAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)

年，卷(期)：2008，29(1)

引用次数：1次

1.马延和新的生命形成 1999(1)

2.张树政微生物多样性的全球影响 1995(1)

3.李大卫极限环境中的生命 1995(1)

4.Worse C R Bacteria Evolution 1987

5.徐毅嗜盐古细菌的系统发育分析 1996(2)

6.Adams M W W.Perler F B查看详情 1995(7)

7.Georqes F The research of enzyme in microbiology 1996

8.Bruins ME.Janssen AE.Boom RM Thermozymes and their applications 2001(155)

9.朱非.王珊.周培瑾低温酶冷适应的分子机制及其在生物技术中的应用[期刊论文]-微生物学报 2002(5)

10.Horikoshi K Alkaliphiles:some applications of their products forbiotechnology 1999(4)

11.徐恒平.张树政嗜极菌的极端酶 1997(1)

12.柳耀建.林影.吴晓英极端微生物的研究概况[期刊论文]-工业微生物 2000(3)

13.王柏婧.冯雁.王师钰.孔祥菊.曹淑桂嗜热酶的特性及其应用[期刊论文]-微生物学报 2002(2)

14.Phoebe CH bie J Extremophilic organisms as an un2explored source of antifungal compounds 2001(1)

15.顾觉奋抗癌微生物药物的研究与开发 1991

16.厉云.向华.谭华荣极端嗜盐古菌蛋白类抗生素——嗜盐菌素[期刊论文]-微生物学报 2002(4)

17.任红妍嗜热微生物 1995(5)

18.徐恒平嗜极菌的极端酶 1997(1)

19.刘岳峰嗜盐微生物的应用现状和展望 1992(2)

20.陶卫平嗜盐菌的嗜盐机制 1996(1)

21.陈漱嗜碱细菌研究进展 1991(3)

22.Rothschild JJ.Mancinelli RL1Life in extreme environments 2001(6823)

1.学位论文丁燏南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L谷胱甘肽及其相关酶的研究2005

极端微生物的研究自20世纪70年代以来引起全世界的广泛关注，已成为当今研究热点，它们在极端环境长期适应过程中形成了独特的性质。对它们的研究不仅对了解生命的极限、进化与分类等很有理论价值，而且对环境污染、生态、微生物新功能等具有重要的实际意义。南极冰藻是极地海洋生态系统中重要的初级生产者，在南极海洋生态系统中具有重要的地位和作用。 谷胱甘肽系统在清除活性氧和生物保护中发挥重要作用，谷胱甘肽(GSH)是抗坏血酸-谷胱甘肽循环的重要组成成分，在维持胞内氧化还原水平具有不可缺少的作用；谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)催化H2O2和脂质过氧化氢的还原，保护细胞免受氧化伤害；谷胱甘肽硫转移酶(GST)催化谷胱甘肽与各种有毒的亲电化合物发生结合起到解毒作用；谷胱甘肽还原酶(GR)是维持谷胱甘肽库处于较高还原水平的关键酶。南极生物存在的环境特殊，温度低、干燥、高盐度、强辐射、随季节极度变化的光照强度，以及海水中较高浓度的溶解氧，使得自由基的产生非常容易，近年来对其研究越来越多，它们应该具有更有效的机制来清除活性氧。本研究拟探讨南极冰藻胞内谷胱甘肽含量；并以硅藻GJ01为材料研究影响谷胱甘肽水平的因素、进一步优化条件提高其产谷胱甘肽的能力；以南极衣藻ICE-L为材料从谷胱甘肽及其相关酶的角度，进一步阐明南极冰藻的适应机制(包括低温和重金属)，对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶进行分离纯化，得到均一产品，详细阐明该酶的性质。该项研究不仅能为谷胱甘肽新来源的获得提供科学依据，而且能进一步完善南极冰藻对胁迫的适应机制，为抗逆性品种改良等方面提供新的思路。 (1)用分光光度法对24种已鉴定或初步鉴定的南极冰藻，胞内谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成能力(GPA)、谷胱甘肽还原酶活力等进行测定。测定结果表明南极蓝

谷胱甘肽合成能力低于三角褐指藻的。南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶活力高于对照组的。培养基的选择表明，f/2培养基适合南极硅藻GJ01的生长，而Provasoli培养基适合南极衣藻ICE-L的生长。鉴于南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L的谷胱甘肽总产量和谷胱甘肽合成能力等，高于对照组和其他南极冰藻的，故选取这两种南极冰藻作进一步深入研究。可见，南极冰藻成为谷胱甘肽的新来源是有可能的。 (2)以南极硅藻GJ01为对象，探讨它的生长规律、胞内谷胱甘肽含量随时间的变化规律、不同培养基补加方式对谷胱甘肽含量的影响，同时也测定其谷胱甘肽合成能力和谷胱甘肽还原酶活力的变化。结果表明，南极硅藻GJ01的生长对数期在6-10d之间，完整的生长周期在14d以上；谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成能力、谷胱甘肽还原酶活力随生长时间而发生周期性变化，对数期后期和稳定期初期是收获谷胱甘肽的最佳时机。9d前保持较高的谷胱甘肽合成能力和谷胱甘肽含量

；3d左右谷胱甘肽还原酶的活力最高。 当培养物培养6天到8天后，每2d加入一定量的新鲜培养液，可以达到谷胱甘肽较高的得率，提高了谷胱甘肽合成能力，也增加了蛋白质的合成。但是谷胱甘肽还原酶的变化规律不明显。可见细胞中谷胱甘肽含量不仅与生长时间有关，而且还与培养方式等有关。这些规律的认识对冰藻的实际应用具有指导意义。(3)以南极硅藻GJ01为材料，测定营养条件和谷胱甘肽的前体氨基酸等因子对硅藻GJ01生长和产谷胱甘肽的影响，并对硅藻GJ01细胞和非细胞酶耦联硅藻GJ01ATP再生系统，合成谷胱甘肽的条件分别进行优化。结果表明，在单因子影响条件下

，1.2g/L的碳酸氢钠对南极硅藻GJ01的生长最好，且最有利于谷胱甘肽的积累；800μmol/L氯化钙对GJ01的生长最为有利，而200μmol/L氯化钙对谷胱甘肽的产生是适宜的；维生素B12和生物素对GJ01谷胱甘肽的产生影响较小；硅藻GJ01谷胱甘肽合成系统酶的最适温度为10-25℃，最适pH为7.0；Glu、Cys、Gly的最适浓度分别为24mmol/L、12mmol/L、8mmol/L，此外Met对谷胱甘肽的合成也有影响；硅藻GJ01的谷胱甘肽合成能力是Mg2+依赖性的，其最适浓度在10-20mmol/L之间。正交试验表明，硅藻GJ01细胞产生谷胱甘肽的最优条件为，光照为16h光/8h暗，NaHCO3为1.6g/L，Ca2+为0.4mmol/L，Cys为10mmol/L；硅藻GJ01游离谷胱甘肽合成酶系和完整细胞ATP再生系统耦联，产生谷胱甘肽的最理想条件为，温度30℃、Cys为10mmol/L、Mg2+为

30mmol/L、pH为7.5。 (4)以南极衣藻ICE-L为材料，对其在不同温度条件下谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽还原酶活力、以及谷胱甘肽和蛋白质含量进行测定，以阐明谷胱甘肽系统在低温适应中的作用。结果表明，谷胱甘肽系统在南极衣藻ICE-L低温适应过程中，谷胱甘肽、谷胱甘肽硫转移酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶与低温适应呈正相关，随着温度的降低，谷胱甘肽含量增加，这三种酶的活力都提高；同时除谷胱甘肽还原酶外其他因子与南极衣藻ICE-L高温适应呈负相关，温度高于最适温度时谷胱甘肽还原酶活力增加，谷胱甘肽含量下降，谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力降低，蛋白质随温度变化规律不明显。可见谷胱甘肽及其相关酶在南极衣藻ICE-L低温适应过程中具有重要作用，这是对低温适应的保护机制之一，能够有效地清除活性氧，保护细胞免受伤害。 (5)随着人类活动的加强，Cd极有可能出现在南极，它是一种毒性强且非常普遍的重金属污染物。本文研究Cd对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽水平及其相关代谢酶的影响，以阐明南极冰藻的谷胱甘肽系统在其重金属适应中的作用。Cd能引起衣藻ICE-L生长速度减慢、丙二醛含量增加，谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽硫转移酶活力得到提高，可见谷胱甘肽系统在抗重金属胁迫中也具有作用。超微结构表明，当Cd浓度增加至160μmol/L时，淀粉颗粒和类囊体片层的破坏加重，空泡化明显，且原生质体发生收缩，膜变形，细胞壁变得不清且出现缺痕，这种变化对生长代谢可以造成明显的影响。这些参数可以用来反映Cd或其他重金属污染对南极生物圈的生物学影响。

(6)以硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析和凝胶过滤等方法，对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶进行分离纯化。结果表明，南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶纯化物总蛋白为0.05mg，总纯化倍数达12771.4倍，总回收率为25.1％，酶的比活力为178.8000U/mg，电泳表明达到均一性。谷胱甘肽还原酶亚基的表观分子量为54.6kDa，与已知的谷胱甘肽还原酶的大小是非常相似的。谷胱甘肽还原酶对NADPH的表观米氏常数Km~DPH为23.3μmol/L、对GSSG的表观米氏常数KmGSSG为66.0μmol/L、对NADH的表观米氏常数KmNADH为83.8μmol/L。其中KmNADPH比许多已知酶的要大，且能够以NADH为底物，这在谷胱甘肽还原酶中是不多见的。 (7)在对南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶分离纯化的基础上，对其性质进行系统的测定，包括pH、温度、缓冲液、离子强度、无机离子、螯合剂、酶保护剂等对该酶的影响。结果表明，该谷胱甘肽还原酶的最适pH为7.5，强碱性对其活性影响比较大。最适温度为25℃，对高温具有不稳定性，活化能为3.7kJ/(mol·K)，-78℃保藏是最佳的保藏方法。最适缓冲液是50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，最适离子强度为90mmol/L，最适

Mg2+为7.5mmol/L。 (NH4)2SO4(1mmol/L)、Ca2+、Mg2+以及与谷胱甘肽有关的巯基化合物和ATP等，对谷胱甘肽还原酶有促进作用；螯合剂不同程度地抑制谷胱甘肽还原酶的活力，其中EGTA作用最强；重金属离子如Cd2+、pb2+、Cu2+、Zn2+等对谷胱甘肽还原酶的抑制率达100％；表面活性剂、酶保护剂、NEM、NADPH和ADP对谷胱甘肽还原酶均具有抑制作用。表明南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶是低温酶。综上所述，南极冰藻中谷胱甘肽含量较高

，并且通过条件优化，使南极硅藻GJ01在谷胱甘肽生产上的实际应用成为可能。南极冰藻在长期进化过程中已形成了相应的适应机制，谷胱甘肽系统在对抗低温和Cd的胁迫中具有重要作用，谷胱甘肽含量增加和酶活力提高有利于及时清除活性氧和解毒。南极衣藻ICE-L谷胱甘肽还原酶的分离纯化，表明它与其他来源的谷胱甘肽还原酶具有异同点，且具有低温酶的特性，这对谷胱甘肽还原酶资源和低温酶适应机制等方面的研究具有重要意义。

2.学位论文李丽盐碱环境中放线菌多相分类及免培养研究2006

本文综述了盐碱环境下放线菌研究的目的和意义，介绍了极端微生物特别是嗜盐放线菌的分离、分类研究的进展及其应用前景；着重介绍了放线菌分类学的研究现状，多相分类的研究方法以及当今的研究特点和发展趋势；同时介绍了微生物分子生态学，特别是免培养技术的基本原理、常用方法和在实际中的应用。 本研究以我国宁夏典型盐碱地土样作为研究对象，进行放线菌的分离和筛选，对不同培养基的放线菌分离效果影响进行了探讨；并对分离到的菌株和本室保存的菌株进行形态特殊，耐盐性和产特殊抑菌活性物质菌株的筛选，采用多相分类技术对筛选的放线菌进行系统的分类研究，从表型、基因型及系统发育三个不同层次对其分类地位进行了最终确定。同时，利用免培养技术对盐碱环境微生物的多样性分析进行了尝试。研究结果表明： 1不同营养成分、盐离子类型和盐浓度培养基的设计，更有利于提高该地区盐碱环境中放线菌的获得，并揭示了宁夏典型盐碱土中放线菌数量和种类的分布规律。 2依据形态特殊、高耐盐性和对农业生产中常见病原菌产生特殊抑制活性物质放线菌的筛选，获得了60株稀有菌株、耐18％NaCl菌株和具有特殊功能的菌株(稀有放线菌33株，耐盐放线菌22株和产特殊抑菌活性物质放线菌5株)，为稀有放线菌的发现及功能菌的应用提供了良好的出发菌株。 3采用形态学、生理生化特征、细胞化学、以及16SrDNA序列分析等多相分类技术手段，从表型、基因型及系统发育三个不同层次最终确定了供试放线菌的分类地位。确定产特殊抑菌活性物质菌株02d01、13h06、14i18、43a04和56h02为链霉菌(Streptomyces)，形态特殊菌株

09j02为拟无枝酸菌(Amycolatopsis)，耐盐菌株59h05为诺卡氏菌(Nocardia)，其他形态特殊菌株和耐盐菌株均为拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)。

4构建供试菌株与拟诺卡氏菌属各种间的16SrDNA序列系统进化树表明：菌株09j03和47d01与已知种为N.synnemataformans.Y13593系统发育关系最近，菌株04d01与N.synnemataformans.Y13593系统发育关系最近。菌株68d14与N.dassonvilleisubsp.albirubidaX97882系统发育关系最近。菌株20f03和

22f02与N.exhalans.AY036000系统发育关系最近。菌株07j03与已知种N.halotolerans.AJ290448聚成一群，且形成一独立的深度分支，二者进化距离高达0.021，极可能给予新种的分类地位，菌株21f15与N.chromogenes.AY619715聚为一个小群，又与已知种N.halophila.AJ421018和

N.baichengensis.AY619716所形成的一个小群之间聚为一个独立的大群，21f15与三者的进化距离分别为0.011、0.021、0.016，也极可能给予新种的分类地位。 5在用免培养法对5种不同土样中微生物的多样性研究中，富集培养对环境中微生物多样性的分析均优于平板计数法和免培养法，而免培养法又优于平板计数法。 6采用六种方法提取DNA，液氮法提取DNA得到的条带数最高，数量为18；其次为酶解法和微波法，酶解法不同处理分别为18和13，微波法不同处理分别为15和16。另外，富集培养将所有样品的DNA混合后得到的条带数(21)虽然高于免培养中用单一方法提DNA得到的条带数

，但却明显低于将不同提取方法的DNA混合后得到的条带数(26)。 我国西北部地区有着丰富的盐碱环境资源，为放线菌的开发提供了巨大的宝库。本研究对于指导盐碱环境中未知嗜盐和耐盐放线菌的分离培养，加速这类重要的微生物资源的开发利用具有重要的理论意义，并将为微生物资源开发利用提供新型菌种，为生物多样性研究积累资料。

3.期刊论文张永光.李文均.姜成林.张忠泽嗜盐放线菌的研究进展-微生物学杂志2002,22(4)

嗜盐放线菌是极端微生物的重要组成部分,也是一类极具应用前景的微生物资源.就嗜盐菌的分类标准、嗜盐放线菌的分离、分布及系统学研究的历史、现状及其发展趋势、应用前景进行了概述.同时还讨论了嗜盐放线菌的分离及其生理学、分类学研究中存在的问题及困难.

4.学位论文陈兴麟深海沉积物中甲醛降解菌多样性分析和相关基因的克隆2009

深海、南极等极端环境中蕴藏着丰富的资源，其中微生物资源是国内外研究的热点。它们经过长期的进化、选择，在各种极端的环境条件下形成了独特的组织结构、酶系统及代谢机制以进行生存和繁衍。对适冷酶独特的生理结构及机能进行研究，探讨生物适应恶劣的生存环境而产生的解毒机制

，无论在科学上还是实际开发应用上都具有重大的意义。由于极端环境样品采集方面的限制，目前大部分的极端微生物仍未得到认识和研究。 本文对东太平洋深海沉积物、印度洋深海沉积物、南极普里兹湾沉积物样品开展研究。采用传统分离微生物手段获得可培养微生物共323株，并从中筛选到83株耐受甲醛浓度在50mg/L以上的甲醛耐受菌株及7株产适冷脂肪酶的菌株。 在甲醛耐受菌中，FA15菌的甲醛耐受能力最强，其在完全生长的条件下，能耐受至少4000mg/L浓度的甲醛，大大高于多数现有文献的记载。同时，FA15菌能在以甲醇或乙醇为唯一碳源的M9培养基上生长，显示了部分“甲基营养菌”的特征。并且将FA15菌体破碎后，其破碎液在3h内能完全降解100mg/L的甲醛。说明FA15菌株发酵产生能够降解甲醛的物质，用于降解甲醛时，不需要FA15活菌，这为实际开发应用提供了极大便利。 同中温酶相比，适冷脂肪酶具有极高的催化常数（Kcat）值，同时有较低和较稳定的米