细菌的培养和分离

(1)能分解尿素的细菌代谢类型为＿＿＿＿，应从富含 有机质的土壤表层取土样。 (2)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用＿＿＿＿ 的培养基进行分离，并加入＿＿＿指示剂进行鉴别。 (3)若取土样5g，应加入＿＿ml的无菌水配制成稀释10 倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀 释，配制成如图14所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀 释前，一定要＿＿＿以减少误差。将103-107倍的稀释 液分别吸取0.1mL加入到固体培养基上，用＿＿＿＿将 菌液铺平。这种接种方法称为＿＿＿＿。
二.接种技术（分离纯化技术）
方法 用具
方法
平板划线法
接种环或接种针
分区划线，形成单细 胞菌落。划线前后和 两次划线之要间灭菌
稀释涂布平板法 移液管，涂布器
将菌液进行梯度稀释 后(每次稀释10倍) ， 取样，用涂布器涂
用途
分离，鉴别
分离，鉴别，计数
梯度（系列）稀释：（1）方法：取样品1ml，放入9ml无 菌水中，每次稀释10倍，重复操作。
第二部分.细菌的培养技术 (分离和计数)
第一节.细菌的培养技术(分离和计数)
一.培养基的配制技术 (一)微生物的营养物质
营养物质
种类
功能
碳 无机： CO2、NaHCO3 提供碳骨架,用于合成 源 有机： 糖类,脂肪,蛋白质 有机物，提供能源物质
氮 无机： 铵盐、硝酸盐、N2 源 有机： 尿素,牛肉膏,蛋白胨
实验４：将突变体ａ1和ａ2一起接种于一般培养基， 数日后出现菌落。 探究实验４中出现菌落的原因(要求：提出问题， 提出假说,设计实验程序，预期实验结果，分析相 应实验结果得出的结论)。
第一节.细菌的培养技术(分离和计数)
(三)固体平板培养基配制程序 1.称量：天平 2.溶解：加热 3.调PH值：PH试纸、NaOH、HCl。 4.包扎灭菌：高压蒸汽灭菌 5.倒平板：培养皿，超净台 6.固体平板培养基应倒置存放
用途：分离、纯化和计数
倒平板操作的讨论
1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用 什么办法来估计培养基的温度？
用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时 即可开始倒平板。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基 表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表 面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培 养基，造成污染。
碳源是来自培养基中的
，实
验需要振荡培养，由此推测“目的菌
”的代谢类型是
。
（3）培养若干天后，应选择培养瓶 中化合物A含量 的培养液，接入新
的培养液中连续培养，使“目的菌”
的数量
。
重 复 多 次 直 至 振荡培养若干天后，测定各瓶中化合物A的含量 获 得 目 的 菌
固体培养基
（4）转为固体培养时，常
（2）优点：减小稀释误差，获得不同稀释倍数的样品。
（3）注意：每次稀释前，应将样品震荡或反复吹吸，
混合均匀。
样品菌数含量（个/ ml ）= 菌落平均数×稀 释倍数÷接处稀释液体积（ml） 练一练
某同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板 上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的 菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为 0.1ml）( A )
问题3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？ 如果不同，请分析产生差异的原因？
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不 同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。
问题4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析 其可能的原因。
无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可 能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了 污染。
乳糖 5.0克
为_鉴__别__培养基,利用该培养
KNO3
2.0克
基的目的是_鉴__别__大__肠__杆__菌___. 伊红-美蓝 0.2克
(2)根所物理性质分,该培养 基称为_固__体___培养基,该培养 基可用于微生物的_分__离__和__计__数.
琼脂 水
12.0克
定容至 1000ml
(3)该培养基中能提供碳源的是_牛__、__葡__、__乳___,能提供
31。某化工厂的染水池中，含有一种有害的、难于降解 的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以
及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化 合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。 请分析回答问题：
（1）培养基中加入化合物的目的是
筛选
，这种培养基属
于
培养基。
（2）“目的菌”生长所需的氮源和
5．人们利用某些微生物制作食品时，需要分析微 生物的特点，控制微生物的发酵条件。下列与此 有关的各项内容都正确的是
食品
主要 微生物
制作装 置或操 作步骤
A 果酒 酵母菌
B 果醋 醋化醋杆菌 （醋酸菌）
C 腐乳 毛霉
D 泡菜 醋酸菌
发醉法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量有机物， 可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养 、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下：
选择 特定种类微生物生长， 素培养基能分离出酵母菌和
按用
抑制其它微生物生长。 霉菌但抑制细菌放线菌生长
途分
加入指示试剂，使菌 鉴别菌种。如伊红-美蓝可
鉴别 落或菌落周围出现特 使大肠杆菌的菌落呈现出紫
定的颜色或形态变化。黑色。
配制何种培养基可选择出下列微生物?
土壤中的固氮微生物 能分解有机污染物A的细菌 分离土壤中能分解纤维素的细菌 分离土壤中能分解尿素的细菌 分离金黄色葡萄球菌（耐盐）
琼脂 水
12.0克
定容至 1000ml
(3)该培养基中能提供碳源的是_牛__、__葡__、__乳___,能提供
氮源的是牛__肉__膏__、__K_N_O,3从培养基成分来分析,该培养基 所培养的微生物的同化作用类型为_异__养__型_。
实验设计：
实验１：将Ａ接种于一般培养基，结果出现菌落。
实验２：用放射线处理Ａ，以产生突变体ａ1，将 其接种于一般培养基，不出现菌落。但在培养基中 添加物质甲后，就出现菌落。 实验３：另用放射线处理Ａ，得突变体ａ2，将其 接种于一般培养基，也不出现菌落。但在培养基中 添加营养物质乙后，就出现菌落。
发醉法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量有机物， 可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养 、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下：
（3）为确定菌体产量，图中②操作之前，应先称量 _______________的质量。过滤后需反复烘干称量，直至 _____________________。所得菌体干重等于________。
结果分析与评价
1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌 落生长，说明了什么？
未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长， 说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的 菌落？它们的大小、形状、颜色相似？
如果接种成功的话，在培养基的表面可察到大小、 形状、颜色相似的菌落。
1.试管低温临时保存 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落 后，置于4OC的冰箱中保存。
2.甘油管长期保存 在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的 冷冻箱中保存。
六.微生物数量的测定 1.血球计数板计数法 （显微镜直接计数法）
将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均 放到370C的恒温箱中，培养12～24h后进行观察并 记录结果。
三.培养技术.
1.将接种后的培养基放入恒温培养箱培养,温度 一般为20--25℃,固体平板培养基要倒置.
2.用稀释涂布平板法接种,要培养到菌落数不再 增多(稳定)时, 选择菌落数在30—300之间的稀 释组计数,如实记录数据.
在生态系统中充当________。 ▪ 只能利用有机碳源的生物属于______生物，
在生态系统中充当________。
第一节.细菌的培养和分离
(二)培养基的类型
分类 类型
物理 液体 性质 固体
成分
无凝固剂 加凝固剂(琼脂)
作用
培养(扩增)、分离
分离,计数,鉴别
某化学物质有无，允许 分离特定微生物，如含青霉
第一节.细菌的培养和分离
四.无菌操作技术
1.方法
（1）消毒 用温和的理化方法（酒精、紫外线）来杀 死物体表面和内部的微生物。
（2）灭菌 用强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生 物（包括芽孢和孢子）。 1.灼烧灭菌
灭菌 2.干热灭菌： 3.高压蒸汽灭菌： 4.砂芯漏斗过滤灭菌（对尿素溶液）
第一节.细菌的培养和分离
采用 的方法接种，获得
单菌落后继续筛选。
（5）若研究“目的菌”的
生长规律，将单个菌落进行
液体培养，可采用
的
方法进行计数，以时间为横
坐标，以
为纵
坐标，绘制生长曲线。
（6）实验结束后，使用过
的培养基应该进行
处
理后，才能倒掉。
重
复
多
次
直 至
振荡培养若干天后，测定各瓶中化合物A的含量
获
得
目
的
菌
固体培养基
下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验 过程，据图回答：
（1）实验过程中培养白地霉的培养基是_________。 培养基定量分装前，先调节____________, 分装后用棉 塞封瓶口，最后______________________处理。
（2）图中 ① 过程称为__________，从甲到丁的培养 过程是为了_______。白地霉的代谢类型为_________。
A.2.34× 108 个菌落/ ml B.2.34× 109个菌落/ ml C.2.34× 106个菌落/ ml D.23.4个/ 菌落ml
涂布平板操作讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板 划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何 进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与 培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸 管要在酒精灯火焰周围；等等。
缺点
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动微生物的计数； 只能测量含量较高的样品； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
六.微生物数量的测定 2.稀释涂布平板法 (活菌计数法)
每毫升或每克样品菌数 = 菌落平均数×稀 释倍数÷稀释液体积(0.1ml) (待菌落数稳定时计数，菌落数少于活菌数) 3.滤膜法 (测活菌数) 饮用水中微生物的测定
生长因子 维生素、氨基酸、 (微量有机物) 碱基、核苷酸
合成蛋白质、核酸、氨 基酸、碱基。
生长不可缺少，自身已无 法合成(酶,核酸的组分)
水和无机盐
PO43- SO42-等
维持渗透压，PH，原料
牛肉膏,蛋白胨：分别是牛肉和大豆的水解产物（主要是多肽）。
问题讨论2：判断对错
▪ 同一种物质不可能既作碳源又作氮源。 ▪ 凡是碳源都能提供能量。 ▪ 除水以外的无机物仅提供无机盐。 ▪ 能以氮气为氮源的微生物为_______生物。 ▪ 能利用无机碳源的生物属于型_______生物，
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿 盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上 滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
练习：观察表格中培养基成 牛肉膏 5.0克
分数据，回答问题：
葡萄糖 10.0克
(1)根据用途分,该培养基称
说出碳源和氮源即可。
练习：观察表格中培养基成 牛肉膏 5.0克
分数据，回答问题：
葡萄糖 10.0克
(1)根据用途分,该培养基称
乳糖 5.0克
为_鉴__别__培养基,利用该培养
KNO3
2.0克
基的目的是_鉴__别__大__肠__杆__菌___. 伊红-美蓝 0.2克
(2)根所物理性质分,该培养 基称为_固__体___培养基,该培养 基可用于微生物的_分__离__和__计__数.
已知体 过滤 滤 放入 伊红美蓝培
积的水 膜
养基培养
统计黑色 菌落数量
七.微生物的分离纯化
平板划线法, 稀释涂布平板法, 选择培养基分离法, 鉴别培养基分离法。
练一练 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数 目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低
2.无菌技术实例
操作对象
无菌技术
操作空间(超净台)
紫外线灯消毒
培养基
高压蒸汽灭菌（121˚C）
玻璃器皿,金属用具
干热灭菌（160˚C）
接种环,涂布器,管口瓶口
灼烧灭菌
接种,倒平板等实验操作 在酒精灯火焰附近进行
衣着和手
酒精消毒
3.人工操作方法： 各种操作均应在超净台的酒精灯火焰附近进行
五.培养和保存纯化菌株
氮源的是牛__肉__膏__、__K_N_O,3从培养基成分来分析,该培养基 所培养的微生物的同化作用类型为_异__养__型_。配制该平
板培养基培养基的程序为称量、溶解、_调__P_H_值_______、
_高_压__蒸__汽__灭__菌___、___倒__平__板_____。
第一节.细菌的培养和分离