石斛兰的组织培养

石斛兰的组织培养

作者：杨恩富专业：设施农业技术

班级：设农08-1班学号：33号指导教师：陈霞

[摘要]：运用组织培养相关知识，对石斛兰做了简单的组织培养阐述。大致方向为：（一）培养目的——通过石斛兰的组织培养，加强我对石斛兰的了解以及石斛兰在组织培养中所注意的事项，同时为学习组织培养这门课程打下坚实的基础；（二）培养方法——选择石斛兰的叶片、茎段腋芽、根系在营养基中进行组织培养；（三）简单介绍石斛兰生根培养和炼苗技术。

通过本篇论文，加强自身对石斛兰的了解，并对其生理特性有一定的认知。组织培养技术，用组织培养法繁殖植物，这是组织培养应用于生产的主要的和成效最大的实例。所以，石斛兰的组织培养，更加肯定了组培价值所向。关键词：石斛兰组织培养炼苗

一、石斛兰(Dendrobium) 的概述

石斛兰(Dendrobium)属兰科多年生附生落叶或常绿草本植物，原产中国、日本及澳大利亚等国家，是一种观赏价值很高的花卉，其花姿态优美，花色艳丽多彩，花多而且花期长，深受人们喜爱。石斛兰有600种原生种，连混合交配种在内约有7000种。从形态上可分节生种和蝴蝶兰花形种两大类。在繁殖上，因为几乎所有的观赏类石斛都是杂种，通过种子播种不能得到大量与亲代形状一致的植株。目前石斛兰主要采用分株繁殖，繁殖速度缓慢。我国从20世纪70年代中期开始，对石斛的组织培养进行了大量研究，进展很快。但目前石斛兰的组织培养采用的外植体基本上都是茎尖、新生芽，由于每株植株体上这些材料有限，所以茎尖、新生芽作为外植体材料的组织快繁在生产上应用难度较大。虽然通过叶片诱导能够诱导出类原球茎，如Sagwa等采用幼茎的侧芽和顶尖的分生组织分化出类原球茎。但由于石斛兰类原球茎的诱导机理没有研究清楚，通过类原球茎分化完整植株的途径还有很大的难度。

二、外植体的选择

无菌外植体的获得:从无病虫害的母株上选择健壮、叶片未展开的幼芽，用已消毒的刀片切取4～12cm，并将外围叶片剥除,仅留顶端 O – 3cm叶鞘，放入锥形瓶中，用纱布封闭瓶口，自来水流水冲洗 3 0 min，然后用 7 0 ％酒精消毒1min，1‰ HgCl，处理 8min,最后用无菌水洗 4～5次,将外植体置入无菌烧杯,切取的芽体直径约 1.2cm、高 2.0 ～ 5.0c m，呈锥螺状，具顶芽 1个、腋芽 3 ～ 4个( 每层各有 1个) 。将芽体用 0.1 ％升汞溶液浸泡10min、无菌水冲洗 3～5次后、切除叶鞘。然后将顶芽与腋芽分开，取从下往上数第 2～3个腋芽作外植体( 第 1 个腋芽较难消毒，

第 4个芽易成苗、较难诱导出原球茎),备用。

三、石斛兰各组织诱导

石斛兰叶片愈伤组织的诱导、石斛兰茎段腋芽的诱导、石斛兰根系的诱导。

（一）石斛兰叶片愈伤组织的诱导

1.叶片愈伤组织诱导培养基

叶片愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，根据生长调节剂的组成、浓度设5个处理。

处理 A：MS+2，4-D5.0mg/L;

处理B: MS+2, 4-D5.0mg/L+ 6-BA1.0mg/L;

处理C:MS+ 2,4-D5.0mg/L+6-BA3.0mg\L;

处理 D,MS+2,4-D 3.0m g/L+6 - B A1.0mg/L；

处理 E，MS+2，4-D3.0m g／L 。5种叶片愈伤组织诱导培养基中均附加琼脂 6dE，蔗糖 2 OL，活性炭 3L，p H值为 5.4～ 5.8 。

2.叶片愈伤组织切块大小

将无菌的幼嫩叶片,用解剖刀切成 1c m×1c m的小块,接种在诱导培养基上。

3.培养条件

温度为25℃，日光照12h，光照强度2 0 0 0LX 。

（二）石斛兰茎段腋芽的诱导

诱芽培养基以 MS为基本培养基，根据生长调节剂的种类和浓度设 3个处理：

1. MS+6-BA 4 .0 mg / L+N A A1.0 mg /L ；

2. MS+ 6 - B A 4. 0mg/L+N A A/1.0mg/ L+K T 1.0m g/ L ；

3. MS+6-B A 0.5m g/L+N A A 0. 5mg/ L+C H 1. 0 m g/ L 。

取无菌茎段，将两端用无菌解剖刀轻轻削去 2～3n l/ n ，将其接种到诱芽培养基上。

（三）石斛兰根系的诱导

设 3个不同的改良的 1/ 2 MS培养基处理。处理 1 : 1/2 M S+I B A 2. 0 m g/ L ；处理 2:1 / 2 MS+I B A2.0 m g/ L+肌醇 2. 0mg/ L ；处理 3: 1/ 2 MS+I B A 2 ． 0 m g ／ L+香蕉汁 1 0 ％。培养基中内含物同“ 1.2.2 ”。选取生长健壮、高 2 c m' 4上的单个芽体分别接人培养基中进行石斛兰根系的诱导。

四、石斛兰生根培养

将诱导出的丛生芽单个分开，可采用以下 2种方法将其接种于生根培养基中：

一步法：于 5 0 0 mL兰花瓶中注入 MS +花宝 1号 3g/ L+ 1.7 ％苹果+ 1.7 ％香蕉+ 1. 7 ％马铃薯的培养基150mL ,接人 2 0株根茎叶分化较完全、株型整齐的健壮小苗。接种后将瓶苗置于

温度 f 2 7 ± 2 ) ℃、光照强度 10 0 O ～ 20 0 0 l x ( 每天连续光照 1 0h) 、加设水帘

风机系统的环境下培养。一步到位定植可避免因个体差异大而导致瓶苗商品价值的下降，培养

3 ～ 4个月后即可出瓶。

二步法

于 5 0 0mL兰花瓶注入 MS + 花宝 1号 2g,L + 1.7 ％苹果+ 107 ％香蕉+ 107 ％马铃薯的

培养基 l 0 0 m L。接人 4 0 — 4 4株“一步法”筛选后剩下的无根、细弱小苗。培养 1 个

月后，按 2 0株／瓶再转接于 MS + 花宝 l号 3g /L + 1.7 ％苹果+ 1.7 ％香蕉+ 1.7 ％马铃

薯或 MS + 花宝 2号 3L + 1.7 ％苹果+ 1.7 ％香蕉+ 1.7 ％马铃薯的培养基中，每 5 o 0 mL

兰花瓶注人培养基 1 5 0 m L 。接种后将瓶苗置于温度( 2 7 ± 2 ) ℃、光照强度 10 O O ～ 2 0 0 0 l x ( 每天连续光照 1 0 h ) 、加设水帘风机系统的环境下培养。

3个月后即可出瓶。“二步法”对初期植入小苗的要求较低。淘汰出变异株后，有根苗

和无根苗均可植入，第 2次转接时调整同瓶整齐度即可。相比较而言，以“二步法”的生根效

果较好，但该方法步骤多且较繁琐，生产成本高。2种方法瓶苗出瓶后大棚恢复的差异不显著，因此在大规模生产中多选择“一步法”，在材料充足的情况下往往将小苗、弱苗淘汰。由于石

斛兰原球茎细胞全能性很强，不添加激素也可分化发育出正常的根、茎、叶，因此生根培养基可不

添加激素。

五、石斛兰（移栽）炼苗

生根培养 3个月后的石斛兰，大多已长出 1 O条根、5片叶和 1 个分蘖，叶片表面的角

质层也已形成，可有效抵抗低强度的光线照射及减少水分散失。出瓶前不需开盖放置，小苗根部

也不需浸泡消毒液，将培养基除干净即可直接出瓶种植。新购的水苔、穴盘和培养杯用清水冲

洗浸泡甩干即可，重复利用的材料必须消毒后方可再用。出瓶后 l 周内，温室光照强度应控制在

l0 0 O l x以内。必要时可于植株上方 l ～ 2 m处加盖 1 层遮荫网：相对湿度控制在 8 5 ％以上。每天喷雾 3 — 4 次可保证湿度。将组培所得的石斛兰苗移人温室，练苗 3d后移栽。移栽前

先洗净组培苗根部培养基，用 5 O﹪的多菌灵可湿性粉剂100 0 倍液浸泡 1 5min,然后移人苔藓基

质中。其移栽成活率为 7 2﹪。在石斛兰的组织培养过程中，会产生褐化。原因是由于植物离体组

织或细胞中的多酚氧化酶被激活，和酚类物质氧化产生棕黄色的醌类物质，并抑制其他酶的活性，

这些酚类物质慢慢扩散到培养基中去，毒害外植体，严重影响离体培养植物组织的生长分化和再生，造成生长不良至死亡。因此，在石斛兰的组织培养过程中，要防止褐化现象的产生，该试验通过在

培养基中加入0.5的活性碳，很好的解决了褐化问题，且发现加活性碳的培养基幼苗生长显著，根

系发达，叶色浓绿。石斛兰组培苗移栽后，成活率偏低，主要原因可能是缺乏共生菌。潘超美等“从

野生建兰和墨兰根中分离、纯化培养收获 4种菌株，发现其真菌对诱导石斛组织培养物( 愈伤组