第五章 血清学反应 免疫学课件
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(2) 结果：阳性---类似粉笔沫样凝集物漂浮澄清液滴中；
阴性----无凝集物，液滴浑浊。
2020/7/6
（3） 用途意义：
① 用已知抗体诊断抗原（病原） ② 也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存
在相应抗体，进行流行病学调查。
常用于布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验 。
2020/7/6
2020/7/6
三、免疫标记技术
（一）原理：抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子
小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。将荧光素、酶分 子、胶体金、放射性同位素等标记在抗体分子上，可以通过检测标记 分子来显示抗原抗体复合物的存在，此种根据抗原抗体结合的特异性 和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术。
标记免疫技术一般分为两类： （1）免疫组化技术(immunohistochemicaltechnique)： 用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。 （2）免疫测定(immunoassay)：用于液体标本中Ag或Ab 的测定。
2020/7/6
第二节 沉淀反应
2020/7/6
一、沉淀反应概述
（一）原理： 可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒
2020/7/6
（3）用途意义： 是一种定性与定量相 结合的方法。用已知抗原检测待测血清中 是否存在相应抗体和测定该抗体的含量。
2020/7/6
（二）、间接凝集试验 1、原理：将可溶性抗原 (或抗体)先吸附于一种与免疫无关的、
一定大小的不溶性颗粒 (统称为载体颗粒)的表面，然后与相应抗体 (或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝 集反应称为间接凝集反应。吸附抗原称为正向；吸附抗体称为反向。
2020/7/6
1、单向扩散试验
2020/7/6
2、/6
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
3、双向双扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等) 与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白 色沉淀，称为沉淀试验。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗 体称为沉淀素。
可溶性抗原+
免疫血清 （抗体）
0.85%或8%NaCl溶液
出现沉淀现象
比例适合
沉淀原
沉淀素
比例不适合
无沉淀现象
2020/7/6
2.抗原性质的分析
2020/7/6
应用
双向扩散试验 3.抗体效价的滴定
2020/7/6
二、免疫电泳技术
2020/7/6
（一）、直接凝集反应
1、原理：颗粒性抗原与抗体（凝集素）直接结合， 并出现凝集现象的试验称作直接凝集试验。
2、方法：直接凝集试验分为玻片法与试管法凝集
2020/7/6
原理示意图
1)、 玻片法
(1) 方法： 将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释)与待检 菌悬液各一滴在玻片上混匀，数分钟后，如出现颗粒状或絮状 凝集，即为阳性反应。此法简便快速。
2020/7/6
（2） 间接血凝试验 (IHAT)
2020/7/6
原理示意图
（3）、协同凝集试验
• 与间接凝集试验的原理相似，只是所用载体而是金黄 色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌的菌体细胞壁中含有A 蛋白(SPA)，SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。因此 当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏 的颗粒载体；如与相应抗原接触，即出现反向间接凝 集试验。适用于细菌和病毒等的直接检测。
常用两类
琼脂扩散试 验
单向扩散试验 双向扩散试验
凝胶免疫电 泳技术
2020/7/6
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
一、琼脂扩散试验
用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的 琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大， 可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万 以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子 量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎 可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化 学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处 理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理 想的扩散介质。
2020/7/6
原理示意图
正向间接凝集反应
载体颗粒
可溶性抗原
2020/7/6
反向间接凝集反应
载体颗粒
抗体
2020/7/6
可溶性抗原
2、方法（载体颗粒不同）
（1）、乳胶凝集试验
伪狂犬病乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒致敏乳胶 抗原来检测动物血清、全血或乳汁中的抗体。具有简 便、快速、特异、敏感之优点。操作方法和结果判定 同直接凝集反应。
第五章 免疫血清学技术
2020/7/6
（二）、经典血清学反应的类型
类型 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应
中和反应
抗原 颗粒性 可溶性 红细胞 G-细菌 外毒素
病毒
抗体 辅助物 凝集素 沉淀素 溶血素 补体 溶菌素 补体 抗毒素 靶细胞 中和抗体 靶细胞
2020/7/6
（二） 特点
1、特异性 ２、结合的可逆性 ３、最适比与带现象
４、反应的阶段性
2020/7/6
（三）经典血清学反应（凝集和沉 淀）的影响因素
1、电解质：常应用0.85%的氯化 钠作为稀释液 ，禽类血清需810%的氯化钠.
2、温度：一般反应在37℃进行 3、pH：pH 6-8
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第二节 凝集反应
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一、 凝集反应
（一）、直接凝集反应 （二）、间接凝集反应
2）试管法
① 试验操作方法
A、取小试管8支，依次编号，第1～7管倍比稀释抗体 B、吸取1:20布氏杆菌抗原，于各管内加0.5ml C、各管摇匀后，置37℃ 24h，观察结果。
② 结果：阳性---液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，沉淀物呈片 状、块状或颗粒状；阴性---液体不透明，管底无凝集
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/7/6
应用
双向扩散试验
1.抗原或抗体的检测 与否以及相对含量的估计
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应用
双向扩散试验
阴性----无凝集物，液滴浑浊。
2020/7/6
（3） 用途意义：
① 用已知抗体诊断抗原（病原） ② 也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存
在相应抗体，进行流行病学调查。
常用于布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验 。
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2020/7/6
三、免疫标记技术
（一）原理：抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子
小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。将荧光素、酶分 子、胶体金、放射性同位素等标记在抗体分子上，可以通过检测标记 分子来显示抗原抗体复合物的存在，此种根据抗原抗体结合的特异性 和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术。
标记免疫技术一般分为两类： （1）免疫组化技术(immunohistochemicaltechnique)： 用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。 （2）免疫测定(immunoassay)：用于液体标本中Ag或Ab 的测定。
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第二节 沉淀反应
2020/7/6
一、沉淀反应概述
（一）原理： 可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒
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（3）用途意义： 是一种定性与定量相 结合的方法。用已知抗原检测待测血清中 是否存在相应抗体和测定该抗体的含量。
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（二）、间接凝集试验 1、原理：将可溶性抗原 (或抗体)先吸附于一种与免疫无关的、
一定大小的不溶性颗粒 (统称为载体颗粒)的表面，然后与相应抗体 (或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝 集反应称为间接凝集反应。吸附抗原称为正向；吸附抗体称为反向。
2020/7/6
1、单向扩散试验
2020/7/6
2、/6
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
3、双向双扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等) 与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白 色沉淀，称为沉淀试验。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗 体称为沉淀素。
可溶性抗原+
免疫血清 （抗体）
0.85%或8%NaCl溶液
出现沉淀现象
比例适合
沉淀原
沉淀素
比例不适合
无沉淀现象
2020/7/6
2.抗原性质的分析
2020/7/6
应用
双向扩散试验 3.抗体效价的滴定
2020/7/6
二、免疫电泳技术
2020/7/6
（一）、直接凝集反应
1、原理：颗粒性抗原与抗体（凝集素）直接结合， 并出现凝集现象的试验称作直接凝集试验。
2、方法：直接凝集试验分为玻片法与试管法凝集
2020/7/6
原理示意图
1)、 玻片法
(1) 方法： 将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释)与待检 菌悬液各一滴在玻片上混匀，数分钟后，如出现颗粒状或絮状 凝集，即为阳性反应。此法简便快速。
2020/7/6
（2） 间接血凝试验 (IHAT)
2020/7/6
原理示意图
（3）、协同凝集试验
• 与间接凝集试验的原理相似，只是所用载体而是金黄 色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌的菌体细胞壁中含有A 蛋白(SPA)，SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。因此 当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏 的颗粒载体；如与相应抗原接触，即出现反向间接凝 集试验。适用于细菌和病毒等的直接检测。
常用两类
琼脂扩散试 验
单向扩散试验 双向扩散试验
凝胶免疫电 泳技术
2020/7/6
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
一、琼脂扩散试验
用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的 琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大， 可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万 以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子 量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎 可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化 学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处 理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理 想的扩散介质。
2020/7/6
原理示意图
正向间接凝集反应
载体颗粒
可溶性抗原
2020/7/6
反向间接凝集反应
载体颗粒
抗体
2020/7/6
可溶性抗原
2、方法（载体颗粒不同）
（1）、乳胶凝集试验
伪狂犬病乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒致敏乳胶 抗原来检测动物血清、全血或乳汁中的抗体。具有简 便、快速、特异、敏感之优点。操作方法和结果判定 同直接凝集反应。
第五章 免疫血清学技术
2020/7/6
（二）、经典血清学反应的类型
类型 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应
中和反应
抗原 颗粒性 可溶性 红细胞 G-细菌 外毒素
病毒
抗体 辅助物 凝集素 沉淀素 溶血素 补体 溶菌素 补体 抗毒素 靶细胞 中和抗体 靶细胞
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（二） 特点
1、特异性 ２、结合的可逆性 ３、最适比与带现象
４、反应的阶段性
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（三）经典血清学反应（凝集和沉 淀）的影响因素
1、电解质：常应用0.85%的氯化 钠作为稀释液 ，禽类血清需810%的氯化钠.
2、温度：一般反应在37℃进行 3、pH：pH 6-8
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第二节 凝集反应
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一、 凝集反应
（一）、直接凝集反应 （二）、间接凝集反应
2）试管法
① 试验操作方法
A、取小试管8支，依次编号，第1～7管倍比稀释抗体 B、吸取1:20布氏杆菌抗原，于各管内加0.5ml C、各管摇匀后，置37℃ 24h，观察结果。
② 结果：阳性---液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，沉淀物呈片 状、块状或颗粒状；阴性---液体不透明，管底无凝集
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/7/6
应用
双向扩散试验
1.抗原或抗体的检测 与否以及相对含量的估计
2020/7/6
应用
双向扩散试验