免疫荧光双标操作方法及注意事项

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;

(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;

(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

三、免疫荧光双标的经验之谈

1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。

5、其余事项同免疫荧光单标操作。

免疫组化双重染色方法和步骤

在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一

冲洗3次，每次5分钟;

9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟

10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;

11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色);

12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;

13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5分钟;

14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟：

15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟

16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟

17.苏木精复染细胞核;

18.水溶性封片剂封片。

在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统进行详细设计。购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂。在选择一抗时应避免定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不可避免，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种不同颜色的荧光重叠后呈现另一种颜色的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光)，它比SP法

的显色系统更容易区别和辨认阳性结果。

在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。