目的基因的获取

（6）引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任 何修饰）， 5’端无严格限制。 （7）引物5′端可修饰 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异 性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补 而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对 PCR反应无影响。

3’
5’ 3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变
PCR 基因放大连琐反应
染色体
PCR 可以把 指定的基因片段 几何放大
2、PCR的基本原理
① ②
试管中进行的DNA复制反应，依据
DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；

①
通过人为控制体外合成系统的温度，使
双链 DNA 变成单链，单链 DNA 与人工合成的引物退 火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。
目的基因的获取
1、什么是目的基因 2、目的基因获取途径 3、PCR法制备方法及过程

一、什么是目的基因 目的基因：是指基因工程操作中需要的外 源基因，它是编码某种蛋白质的结构基因， 如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。 从目的基因的概念来看， 最原始的目的基 因是指从某甲种生物体内直接获得， 然后 转入已知的某乙种生物体内并让其成功表 达以使乙种生物能表现甲种生物的某种特 征的基因。

引物的复性温度的计算公式

Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值－（5～10℃）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性；

复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间 完全结合。



4）、延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互 补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选 择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
5、3 进行PCR反应
5、4 PCR反应体系与流程
反应体系


反应流程


模板（DNA或RNA）
来自百度文库引物
预变性
变性
Taq DNA聚合酶
10×PCR缓冲液 1.5～4 mM Mg2+ 0.2 mM dNTP
退火
延伸 延伸完全 终止
25～35
循环
5、5进行电泳检测

电泳检测：对PCR的结果进行琼脂糖凝胶 电泳检测。（例如下面是VvSUC11基因的电泳
5’
探针标记
5.2 提取基因组DNA
模板DNA的来源： 微生物中提取DNA 植物中提取DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、 精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加

若低于94℃则需延长时间
但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。


3)、退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温 度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓 度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之 间。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想。


需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
二、目的基因的获取
化学合成法
直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应
基因组DNA文库;cDNA文库
三、PCR扩增获得目的基因
1、PCR的含义
聚合酶链式反应 Polymease Chain Reaction(PCR) 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法 ,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反 应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅 速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、 省时等特点。
4、PCR的反应过程演示
5、PCR法克隆基因的技术流程
设计引物
提取基因组DNA
进行PCR反应
进行电泳检测
5.1 设计引物
引物设计的原则： （1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源 序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。
结果）
谢谢！
②
3、PCR的反应过程

1）、预变性：使模板DNA的二级结构充分打开， 让DNA双链充分解离,为了第一次退火过程时候引 物可以尽量多的结合到模板上面。 一般的PCR反应的预变性温度是94℃或95℃，预变 性时间一般设为3-5 min。


2）、变性：使DNA双链解离变为单链。一般 94℃～95℃，1min足以使模板变性