PCR技术的研究进展与临床应用

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编辑　任鸿兰

PCR技术的研究进展与临床应用黄荣宁　综述　周祖文　审校

广西玉林市第一人民医院(537000)

聚合酶链反应(Po lym erase Chain R eacti onm,PCR)是一项体外基因扩增技术,1985年美国PE公司人类遗传研究室M u llis等人发明了该项技术,Saik i等首先应用于镰状红细胞贫血的产前诊断〔1〕,但由于操作方法繁琐未能全面推广应用。直到1988年耐热DNA聚合酶(T aq酶)的发现和应用〔2〕,使PCR技术变得极为简单,才被迅速应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学领域,也使人类疾病的基因诊断进入了临床实用阶段。历经十余年,PCR技术已由当初只能对样品中的DNA和RNA定性分析发展到能够进行定量分析。本文对PCR技术的研究进展与临床应用作一综述。1　定性PCR技术的方法与临床应用

111　PCR扩增的基本方法　PCR扩增过程是一套反复进行的“三步曲”。①变性:双链DNA在94℃左右的高温下变性,形成单链DNA模板。②退火:变性后的单链DNA在55℃左右与反应液中的引物互补结合。③引物延伸:在73℃左右,引物的3端逐个接上与模板碱基互补的核苷酸,形成核苷酸链,这一步在T aqDNA聚合酶和4种单核苷酸存在的情况下完成。“变性-退火-延伸”为一个循环,每一个循环约需3m in,反复进行20～40个循环,即完成了PCR的扩增过程,扩增产物与标准靶DNA样品同时进行凝胶电泳即可确定要扩增的目的DNA存在与否。

112　巢式PCR　即进行两次PCR扩增反应,应用一对引物进行扩增,获取较大的DNA片段,再取少量的产物作模板,以另一对引物扩增其中一部分序列。巢式PCR可以提高敏感性和特异性。

113　等位基因特异性PCR〔3〕,基本原理是设计两个引物,其中一个引物的3端与待扩增基因的野生型碱基互补,另一个引物与待扩增基因的突变型碱基互补,两个引物分别与第3个引物组成两个独立的PCR反应体系,同时检测一标本。因待测基因要么是野生型,要么是突变型,所以只有其中一个反应体系能扩增成功,就可确定基因是否突变。这一技术已应用于多种单基因病的诊断。

114　复合PCR　一般PCR是用一对引物扩增一个DNA片段。如果在反应体系中加入两对以上的引物,就可以同时扩增两个以上基因片段。该技术可使多种或多型病原体的检测一步完成。

115　逆转录PCR　PCR是以DNA为模板进行扩增,如果要检测RNA,则须先以RNA为模板进行逆转录扩增,获得c DNA,再以后者为模板进行扩增,这就是逆转录PCR。116　定性PCR的临床应用

11611　在感染性疾病诊断中的应用　利用物种间遗传基因存在特征的差别,对其进行检测是鉴定感染性疾病病原微生物最可靠最直接的方法,优于细菌学、生物化学和免疫学等传统的方法,已有近百种微生物可通过PCR技术进行检测〔4〕,且大多数的检测试剂已经商品化,国内常用的有各型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒、结核杆菌、淋球菌、幽门螺杆菌、支原体、弓形体等试剂盒。PCR技术用于HBV-DNA的检测,可大大提高检测敏感性,对HBV感染后复制状态及传染性的判断的认识可弥补乙肝免疫检测五项的不足〔5〕。众多的研究表明:HBV感染后,不管s、e系统是否有抗体出现,也不管是否有活动性肝病,应用PCR技术均有可

442・医学信息2001年7月第14卷第7期 综述●