微生物菌种及其复壮与保藏

微生物发酵工程
2 微生物菌种及其复壮与保藏
复习
现代微生物发酵工程研究的内容
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菌种的选育和扩大
最经济地利用营养物，按需确定培养基 灭菌 微生物在最优条件下产物的大规模生产
发酵产物的提取纯化
废物的处理、再生和生产环境的净化
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名词概念
初级代谢产物 次级代谢产物
原理：菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温 之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来。
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液氮超低温法
保护剂：甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋 白等。 不同微生物的保护剂不同，需实验确定。 甘油10-20%，二甲基亚砜5-10% 安剖瓶的选择：95料或GG17的玻璃管制 成。
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菌种制备和冻结保藏：孢子或菌丝体。-35 ℃以前控制降温速度。 恢复培养:38-40 ℃ 水中 注意防护：防冻，防爆。
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菌种保藏注意事项
良好的培养基，新鲜培养的菌种，健壮的 菌体，丰满的孢子，适宜的菌龄
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严格无菌 注意保藏菌种的制备质量 创造最适宜的保藏条件
氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且会造
成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。
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了解退化的原因
减少传代
延缓退化
分离纯化
科学保藏
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2.菌种退化的防止
尽 量 减 少 传 代
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菌种经常纯化
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创造良好的培养条件
用单核细胞移植传代 采用有效的菌种保藏方法
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（五）真空干燥法
常温下直接真空干燥。设备简单，操作方 便。 适于: 预冻后易受冻伤的菌株
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（六）.液氮超低温法
以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下 保藏的方法。 是防止退化的最有效的方法。 适合于各种微生物的保藏。
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3.菌种的复壮及其方法
复壮原理
狭义复壮：从大量退化的菌株中分离筛选到那些仍 保持优良性状的个体 广义复壮：在菌种的生产性能尚未退化前就经常有 意识地进行纯种分离与生产性能的测试工作
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复壮方法
纯种分离
淘汰法
宿主体 内复壮法
平板划线 稀释分离
（四）. 冷冻干燥保藏法
冷冻干燥法:用保护剂制备菌悬液， 然后将含菌样 快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸 汽排出，从而使含菌样脱水干燥， 并在真空状态立 即密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境， 然后 置于低温下保存。 特点：不易发生变异，5-10年。需要冻干机。 适用：除了一些不产孢子的丝状真菌外。
低产株
低产株 增多
高产株
高产株
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质粒脱落导致菌种退化：
控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一 致。
连续传代加速退化的发生：
大量低 产突变株
传代
个别低产突变株
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不良的培养条件如营养成分、温度湿度、pH值、
通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、
特别适合:在固体培养基上不能形成孢子的丝状担 子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、 红曲霉等.
注意：保藏温度，液体石蜡需灭菌和除水
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（三）.干燥保藏法
沙土
麦麸
硅胶
适于:能产 生孢子或 芽孢的微 生物
适合产孢子 的霉菌和放 线菌
适合丝状 真菌和酵 母菌
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特点：简便有效，易变异，退化甚至死 亡。 适合：不要求长期保藏的及不适合冷冻干 燥的。 保存期: 3个月
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影响保藏 效果因素
1 营养略贫乏 氮源略多 糖类少 2
4℃
培养基
保存条件
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（二） .液体石蜡油保藏法
保存期: 2-3年，甚至5年传代一次.
砂土保藏法
砂土
粒度，除钙，除铁及pH 。砂和土混合比例： 1：1或3：2。121℃ 间歇灭菌3次，每次11.5小时
干法 菌种
埋沙土
湿法
沙土管
细胞浓度 108-109 /ml, 0.2-0.3ml/支。抽真空 干燥 4小时 特点:经济简便，保存时间长，不易 变异。一般2-3年.
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产物合成能力下降 产量下降
退 化 的 表 现
孢子数量变化
菌落大小变化
生长能力和生长速度变化
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1.菌种退化的原因
基因突变
连续移代
退化原因
质粒的脱落
培养和保藏 条件的影响
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基因突变导致菌种退化： 自发突变与回复突变 10-7----10-9
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工 业 生 产 常 用 的 微 生 物
2.酵母菌: 单细胞真核, 含糖,偏酸, 出芽繁殖, 假丝…. 啤酒酵母----酿酒、细胞色素C、单细胞蛋 白、 甘油、琥珀酸 假丝酵母----面包、石油脱蜡、饲料 类酵母----脂肪酶
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工 业 生 产 常 用 的 微 生 物
低温等条 件处理, 使部分退 化菌株死亡
对于寄生性 微生物的退 化菌株,可通 过接种到的 昆虫或动物 寄主体内以 提高菌株毒 性
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2.3菌种的保藏
一.菌种保藏 广义：在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基 础上，将它们妥善保管，是指达到不死、不衰、 不污染以便于研究、交换和使用的目的。
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微生物工业对菌种的要求
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纯净 健壮 产量 质量 稳定
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易于控 制培养 条件, 周期短
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原料廉 价,生长 迅速,目 的产物 产量高
不是 病原 菌
对诱变 剂敏感
抗污 染力 强
产物 分泌 型
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2.2 菌种的退化与复壮
菌种退化：生产菌种或选育过程中筛选出来的较优 良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中 某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现 象。
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严格控制传代次数
恢复培养时，要移接到保藏以前所用的 同一培养基进行培养
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思考题
1.菌种退化有哪些原因?如何避免? 2.列举出3种微生物保藏法并说出其适用范围
3.作为工业生产用的菌种必须具备哪些条件
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名词概念
菌种退化 冷冻干燥 复壮
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2 微生物菌种及其复壮与保藏
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工业生产常用的微生物及 要求 菌种的退化与复壮
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菌种的保藏
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2.1工业生产常用的微生物及要求
微生物的多样性
工 业 1. 细菌: 分布最广,数量最多,单细胞原核, 生 产 二分裂殖…. 常 枯草芽孢杆菌---- 淀粉酶、蛋白酶 用 嗜热乳杆菌----乳酸 的 醋酸杆菌----醋酸 微 棒状杆菌----氨基酸 生 短杆菌----肌苷酸 物
3.霉菌:丝状真菌 生产菌百度文库:根霉,毛霉,犁头霉,红曲霉, 青霉等 产品:酶制剂; 抗生素;有机酸;甾体激 素
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工 业 生 产 常 用 的 微 生 物
4.放线菌: 原核生物, 有机质丰富的,微碱性 土壤中, 孢子或菌丝片断繁殖. 生产菌种:链霉菌属;小单孢菌属; 诺卡菌属 等 产品:链霉素; 红霉素; 金霉素;庆大霉素等
狭义：防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优 良的生产性能，尽量减少、推迟负突变、防止死 亡，并确保不污染杂菌。
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干燥
原理
低温
低营养
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微生物菌种的保藏法
3 5 真 空 6
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2
4 冻 干
斜 面
干
液体 石蜡 燥
液 氮
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(一).斜面保藏法