人血浆中全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸浓度的监测

人血浆中全反式维甲酸、１３－顺式维甲酸和９－顺式维甲酸浓度的

监测

【摘要】目的建立高效液相色谱法同时测定人血浆中全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸浓度。方法色谱柱为KromasilC18柱（4．6 mm×250 mm，5 μm）；柱温为室温。流动相A：甲醇；流动相B：0．01 mol/L醋酸钠缓冲液（pH=5．7），梯度洗脱，流速1 ml/min；检测波长340 nm。结果全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸血药浓度在1～200 ng/ml范围内，浓度与峰面积比有良好的线性关系，最低检测浓度为0．5 ng/ml。全反式维甲酸方法回收率为97．22%～108．80%，日内RSD≤8．24％，日间RSD≤11．34%；13-顺式维甲酸方法回收率为98．62%～104．80%，日内RSD≤8．02％，日间RSD≤11．70%；9-顺式维甲酸方法回收率为97．74%～102．24%，日内RSD≤7．72％，日间RSD≤9．17%。结论本方法简单、快速、灵敏、重现性好，适用于全反式维甲酸、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸临床血药浓度监测及人体药代动力学研究。

【Abstract】Objective To establish a HPLC method for determination of all-trans,13-cis-and 9-cis-retinoic acid in human plasma.Methods A Kromasil C18 column （4．6 mm×250 mm，5 μm）was adopted.The mobile phase of gradient elution was composed of 0．01 mol/L sodium acetate buffer (pH=5．7) and methanol.The flow rate was 1 ml/min.The UV detector was operated at 340 nm.Results The assay procedure was shown to produce linear calibration curves over the range of 1-200 ng/ml of retinoic acid in plasma.The detect limitation were 0．5 ng/ml.The recovery of all-trans,13-cis-and 9-cis-retinoic acid were 97．22%-108．80%,98．62%-104．80% and 97．74%-102．24%,respectively.The RSD within day and betten days were less than 8．24％and 11．34% for all-trans retinoic acid,less than 8．02％and 11．70% for 13-cis-retinoic acid and less than 7．72％and 9．17% for 9-cis-retinoic acid.Conclusion This method is found to be reproducible,convenient and sensitive for plasma concentration monitoring and clinical pharmacokinetics study of retinoic acid.

【Key words】

All-trans retinoic acid;13-cis-retinoic acid;9-cis-retinoic acid;Plasma concentration;HPLC

维甲酸是维生素A 的天然氧化代谢产物，有多种立体异构体，包括全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)、13-顺式维甲酸（13-cis-retinoic acid,13-CRA）和9-顺式维甲酸（9-cis-retinoic acid,9-CRA）。其通过维甲酸受体系统而发挥生物学效应，能抑制多种肿瘤细胞增殖，对肿瘤细胞具有诱导分化作用，以及促进细胞凋亡[1]。维甲酸体内代谢异常，可能导致正常细胞分化异常和肿瘤的发生。维甲酸类药物已用于临床，尤其是全反式维甲酸已成为目前治疗急性早幼粒细胞

性白血病的最有效药物之一[2]。通过对维甲酸的药动学研究及体内浓度监测，可提高维甲酸类药物抗肿瘤疗效，有助于开发新的维甲酸类药物抗肿瘤治疗方案。本文参考文献[3-5]，建立了一种灵敏、准确的维甲酸血药浓度HPLC测定法，旨在为维甲酸临床血药浓度监测及人体药代动力学研究提供测定方法。

1 材料与方法

1．1 仪器Waters高效液相色谱仪（600型低压梯度泵，717型自动进样器，486型紫外检测器，Millennium32色谱工作站）；XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；3K18高速冷冻离心机（Sigma）；高速离心机（美国雅培公司TDx仪附件）。

1．2 药品与试剂ATRA、13-CRA、9-CRA对照品(Sigma,纯度：98％)，阿维A酸（内标，罗氏公司）。甲醇为色谱纯试剂，其余试剂均为分析纯。

1．3 色谱条件色谱柱为Kromasil C18柱（4．6 mm×250 mm，5 μm）；柱温为室温。流动相A：甲醇；流动相B：0．01 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH=5．7），梯度洗脱方案见表1。检测波长340 nm。

1．4 血药浓度测定法

1．4．1 ATRA、13-CRA与9-CRA混合标准溶液配制分别精密称取ATRA、13-CRA与9-CRA对照品适量，置于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得浓度为100 μg/ml的ATRA、13-CRA与9-CRA储备液。精密吸取ATRA、13-CRA 与9-CRA储备液适量，置于同一10 ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，制得ATRA、13-CRA与9-CRA浓度分别为0．05、0．25、0．5、1、2．5、5、10 μg/ml的混合标准溶液。

1．4．2 内标液配制取内标阿维A酸适量，置于10 ml量瓶中，以甲醇溶解并定容，即为100 μg/ml的储备液。精密吸取阿维A酸储备液适量，置于10 ml 容量瓶中，甲醇稀释至刻度，制得10 μg/ml内标溶液。

1．4．3 样本处理精密吸取血浆样品1 ml，置10 ml具塞离心试管中，加入内标溶液25 μl，旋涡混合30 s。加入无水乙醇1 ml，漩涡混合30 s，再依次加入2 mol/L醋酸溶液100 μl、水500 μl，漩涡混合10 s。加入正己烷3 ml，旋涡混合1 min，4 500 r/min离心5 min。转移上层液至尖底试管中，氮气流吹干。残渣加入甲醇100 μl 旋涡混合30 s使溶解，10 000 r/min离心5 min，取上清液20 μl进样，记录色谱图，以ATRA、13-CRA、9-CRA峰面积（As）与内标峰面积（Ai）之比Y代入标准曲线计算ATRA、13-CRA与9-CRA血药浓度。

1．4．4 标准曲线精密量取空白血浆1 ml，置10 ml具塞离心管中，分别加入不同浓度混合标准溶液20 μl，混匀，使ATRA、13-CRA与9-CRA血药浓