猪_干扰素的研究进展

猪β-干扰素的研究进展

徐蕙,刘德辉,郭霄峰

(华南农业大学兽医学院,广州　510642)

摘要:干扰素是由干扰素诱生剂诱导生物细胞所产生的一类高活性多功能的糖蛋白,干扰素自被发现以来,由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视。在其基因结构、作用机理及体外重组表达等方面都取得了巨大突破。作者综述了猪β-干扰素的基本特性、作用机理及其临床应用。

关键词:猪β-干扰素;基本特征;作用机理

中图分类号:S852.4 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)12-0120-03

干扰素(IFN )是一种广谱抗病毒糖蛋白,是1957年由英国病毒生物学家A lick Isaacs 和瑞士研究人员Jean Lindenmann 在利用鸡胚绒毛尿囊膜研

究流感干扰现象时发现的,并将其命名为干扰素。干扰素的分子质量一般在20～100ku ,不能透过普通透析膜,但可通过滤菌器,比病毒颗粒小,沉淀病毒的离心力不能沉降干扰素。干扰素的天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量较高,不含核酸,所以不被DNA 酶或RNA 酶破坏,但易被胰蛋白酶、乙醚、氯仿、酮基等破坏,-20℃条件下可长期保存。I 型干扰素具有耐酸性,在pH 2时稳定。Ⅱ型干扰素不耐酸,也不耐热,即在pH 2时不稳定,在56℃条件下30min 会被破坏。干扰素具有广谱性,可抗多种病毒和微生物。

1　IFN -β的类别与组织细胞来源

由于研究角度的不同,干扰素的分类方法有也不同。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构与免疫原性的不同,可将干扰素划分为IFN -α、IFN -β、IFN -γ。其中又根据其对酸的不同敏感性,分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素。Ⅰ型干扰素对酸的耐受性较大,分别有IFN -α、IFN -β、IFN -ω、IFN -δ、IFN -κ、IFN -τ6种类型(银晓等,2008),Ⅱ型干扰素对酸敏感,迄今为止只有IFN -γ一个成员。近年来Ko tenko 等(2003)将Sheppard 鉴定的干扰素新家族命名为IFN -λs (IFN -λ1、IFN -λ2和IFN -λ3)。人类基因组组织(human genome org anizatio n ,H UGO )暂时将它们命名为IL -29、I L -28A 和IL -28B 。IFN -λs 与Ⅰ

收稿日期:2009-05-05

作者简介:徐蕙(1983-),女,广东人,硕士,研究方向:预防兽医

微生物。

通信作者:郭霄峰,男,博导。E -mail :xfgu o @scau .edu .cn

型IFN 有着几乎相同的功能,是否具有独特功能,正在进一步的研究之中(李珊等,2005)。正常的细

胞不产生干扰素,只有合成干扰素的潜力(高建忠等,2004),当细胞受到病毒感染或是诱生剂作用时产生。IFN -β主要由纤维母细胞受诱生剂作用而产生,IFN -α来源于白细胞,而IFN -γ来源于淋巴细胞。2　IFN -β的结构IFN -β因种属不同氨基酸序列也不同。猪与人、牛、马的IFN -β氨基酸同源性分别为65.1%、65.1%和66.1%(曾芸等,2007)。而同一种属的不同品种中,氨基酸序列略有不同,但都在98.5%以上。Antho ny (2002)对干扰素基因研究,得出IFN -α和IFN -β基因位于人9号染色体和小鼠的4号染色体,并连锁在一起。IFN -α和IFN -β氨基酸的同源性为26%～30%(武迎红等,2007)。2.1　猪IFN -β的结构　猪IFN -β基因含有一个561bp 的ORF ,编码186个氨基酸,分子质量约为22ku 。ORF 前21个氨基酸为信号肽,成熟蛋白为分泌型蛋白,有3个潜在的N 端糖基化位点Asn 94、Asn 101、Asn 173,氨基酸序列分别为Asn Asp Se r 、Asn G lu Th r 及A sn A sp Ser ,受体为Asn 上的N 原子。曾芸等(2007)对广西巴马猪的IFN -β进行蛋白质结构预测,得出在成熟的IFN -β蛋白中含有5个α-螺旋结构,分别位于第23-43,72-92,101-128,139-157和160-183位氨基酸残基。第27-177位氨基酸残基区域为IFN -β蛋白与其在细胞表面的Ⅰ型干扰素共有受体的结合区域。M ark 等(1984)报道可用任何氨基酸替代第17位的Cy s ,从而获得一系列IFN -β的同系物。替换第17位的Cys 可采用核苷酸点突变技术,将第17位的Cy s 变成中性氨基酸,如丝氨酸或酪氨酸。第17位的Cy s 对保持IFN -β的空间结构无明显的作用,该Cy s 被Ser 替

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代后不但对其生物学活性无影响,反而使其分子更加稳定,同时也减少其与第141位Cy s形成二硫键的机率。

2.2　人IFN-β的结构　在对人IFN-β结构与功能的研究中,有学者用化学诱变和丙氨酸扫描技术对IFN-β构造中的AB环和E环进行部位位点突变,而Michael等(1997)对人IFN-β的晶体构造进行预测时发现,突变42位Glu或43位Glu为Lys,使IFN-β部分或全部功能丧失,可能是因为Glu43与His121的构象有关,而H is121参与锌结合位点的形成。此外,G lu43被认为是重要功能抗原表位的一部分。在E螺旋中,突变A la142、G lu149、Arg147为Thr、Ly s、A la也会使功能丧失。小鼠IFN-β分子只有一个Cy s17,分子内无二硫键。小鼠成熟IFN-β分子由133个氨基酸残基组成。

3　IFN-β的抗病毒机理

干扰素的抗病毒作用不是直接杀死病毒,而是间接的通过机体细胞来发挥作用的。病毒、细菌、立克次氏体、真菌及原虫等都能诱导细胞产生干扰素。当细胞和机体受到病毒感染,或受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后,由受体细胞分泌出一种广谱抗病毒糖蛋白,即干扰素,它可保护其它细胞抗御多种病毒的感染。同时,干扰素能产生多种抗病毒蛋白,抑制病毒在体内的繁殖。

由干扰素诱导生成的抗病毒蛋白有:①PKR:为双链RNA依赖性蛋白激酶,主要是阻断宿主细胞m RNA合成病毒蛋白质,因而妨碍了病毒蛋白、病毒核酸以及复制病毒时所需的酶的合成,使病毒的繁殖受到抑制(Diebo ld等,2003),干扰素并不影响病主细胞本身的mN RA与核蛋白体的结合,所以不妨碍宿主细胞的生长,几乎是无毒性的(Charles, 2001);②OAS:为2′,5′腺苷酸合成酶,主要作用于内源性RN ase L,激活后的RNase L可降解病毒mRNA,因而抑制了以RNA作为中介的病毒复制(张永,2007);③ADA R1:为腺苷脱氨酶,可将病毒碱基A修饰为I而阻止病毒蛋白质的合成;④M x 蛋白:为GTP结合蛋白,可与病毒核蛋白结合而损伤病毒衣壳蛋白;⑤NOS:为氮氧化物合成酶,可使机体产生NO,NO在免疫防卫中可发挥重要作用(刘运龙等,2008)。

4　猪IFN-β的主要生物学功能

猪IFN-β具有抗病毒活性,IFN-β抗病毒活性较IFN-α弱但比IFN-γ强,IFN-γ和IFN-β能相互加强抗病毒作用。IFN-β具有免疫调节功能,IFN-β干扰素可增强主要组织相容性复合物Ⅰ(M HCⅠ)类分子表达,而强烈抑制M H CⅡ类分子表达,IFN-γ干扰素可促进M H CⅡ类分子表达,两类干扰素的协同调节作用使机体处于最佳免疫应答状态(Dalod等,2002);IFN-β可使Th1、Th2细胞功能保持平衡,减少促炎细胞因子而增强抑制性细胞因子,从而抑制炎症反应;增加抑制性T细胞的活性,减轻免疫应答。IFN-β具有免疫增强功能,且IFN-β可刺激NK细胞并增强其杀伤功能,有利于机体清除病毒感染,使吞噬细胞的活力增强,诱导外周血液中单核细胞的2′,5′寡腺苷酸合成酶的活性。

5　IFN-β的临床应用

在人类医学研究中,多年的临床研究均证实IFN-β治疗复发—缓解型多发性硬化(RRMS)疗效确实,且在一定剂量范围内疗效与剂量、频次呈正相关,IFN-β已经成为治疗RRM S的首选药物之一(谢琰臣等,2006),已被FDA批准用于治疗多发性硬化的复发,可减慢生理残疾的发展,以及延缓疾病的恶化速度,适用于经历了第一个临床间歇期并有与多发性硬化相核磁共振图像(M RI)特征一致的患者。目前,还未建立在慢性进展性多发性硬化患者中的安全性和有效性评价体系。

在一项随机、对照、双盲、多中心的Ⅲ期临床研究中,Jaco bs等(1996)共纳入301例复发性多发性硬化患者接受安慰剂或者1次/周肌肉注射30μg (600万IU)干扰素β-1a,为期2年,试验组中有14%的患者发生了3项或者更多项指标的恶化,而安慰剂组的恶化发生率是32%。干扰素β-1a的耐受性比较好,主要的是轻微的流感样症状,与干扰素β-1b比较,抑郁不良反应的发生率相对较低。Vez-zo li等(1998)用IFN-β治疗10例急性丙型肝炎病毒HCV-Ib型患者,使用6M U,1周3次,持续3个月,可见转氨酶水平明显下降,同时伴有HCV-RN A水平下降,血H IV抑制细胞计数(CD8)水平增高,提示IFN-β对免疫系统起作用,对H CV-Ib型患者有一定的疗效。

在畜牧兽医上,干扰素是一种非特异性广谱抗病毒生物制剂。在对畜禽病毒性疾病,如猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、犬瘟热和犬细小病毒病等的治疗中,采用干扰素治疗,明显提高了治愈率。但IFN-β在动物疾病的临床治疗上相关报道还较为少见。姚清侠等(2007)在毕赤酵母中成功表达具有活性的猪β-干扰素,以细

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