小鼠肝脏细胞原代培养

1瓶
RPMI1640培养液 1瓶
废片缸
1
（四）实验步骤
1.75%酒精棉球擦拭超净台，将试验所 需试剂、耗材等置于超净台中紫外照 射30min后，关闭紫外灯打开照明，通 风15min。
2.取一只小鼠置于含乙醚的废片缸中使 其麻醉，脱臼处死，75%酒精中浸泡并 移置于超净工作台内，将小鼠放在无 菌平皿中，用手术剪和镊子撕开腹部 皮肤，再换一套手术剪和镊子剪开腹 膜暴露内脏。
3.取另一无菌平皿，倒入少许PBS置于 一旁备用 4.用镊子取出肝脏置于含有PBS的无菌 平皿内,清洗2次，除去杂物后，用手术 剪将肝脏剪成1mm³小块。
组织块法：
用镊子夹取组织块并将其转移到克氏 瓶底部，组织块之间有一定间隔（5mm 左右），等组织块粘在克氏瓶上不滑动， 将培养瓶翻转180度组织块朝上，加入 2ml含10%胎牛血清DMEM培养液，盖上 瓶盖，做好标记，37℃ 5% CO2培养箱中 静置培养4小时后待组织块完全粘在克氏 瓶上轻轻翻转克氏瓶，使组织块浸入培 养液中，隔天换一次液，观察细胞是否 贴壁。
3.吸取上层清液加入到1.5mlEP管中， 配平，800rpm，10min，离心。离心 后弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打 混匀，1000rpm离心10min，弃上清， 加入RPMI1640(10%胎牛血清)1ml重悬， 吸取20μl加入到含等体积0.4%台盼蓝 的1.5mlEP管中，混匀吸取20μl血球计 数板计数。
1.组织块法: 2.消化法:细胞数:
将细胞浓度调整到2*106个/ml， 细胞稀释 倍
细胞生长状态: 培养基颜色: 更换培养基次数:
（六）注意事项
1.工作台面上在实验前要用酒精棉擦， 用品要布局合理。 2.用过的培养瓶、离心管等需及时清洗。 3.实验结束后及时清洗用过的玻璃器材、 收拾台面、倒垃圾。
小鼠肝脏细胞原代培养
一班三组 陈嘉慧
（一）实训目的
1.掌握细胞原代培养方法 2.了解肝脏细胞原代培养方法及注意事 项 3.掌握细胞培养用仪器设备的使用、维 护等 4.掌握细胞培养用耗材的清洗及灭菌
（二）基本原理
将肝细胞从小鼠机体中取出，经胰 酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散 成单个细胞，置合适的培养基中培养， 使细胞得以生存、生长和繁殖。
消化法：
1.用无菌滴管吸取剩余组织块于 1.5mlEP管中，加入组织块量5倍消化液 （450微升），置于37℃水浴中消化 30min，每隔5min震荡一次使细胞分离。 当组织块变得疏松，颜色略白时取出。
2.在超净工作台内加入500微升1640 培养液（含血清）终止酶消化作用，静 置10min使未分散的大组织块下沉
（ห้องสมุดไป่ตู้）实验仪器、设备及材料
仪器、设备名称 数量
克氏培养瓶（含瓶 5 盖）
无菌平皿
1
铝饭盒（含镊子、 1 手术剪）
超净工作台
1
台式低速离心机 1
无菌滴管
1
枪头
1盒
血球计数板
3
EP 管
10
微量移液器
3
材料 酒精棉球
数量 1
盖玻片
5
层析缸
1
擦镜纸
1
小鼠
1
RPMI1640(20%胎牛 1瓶 血清）
乙醚
1
PBS 溶液
4.将细胞浓度调整到2*106个/ml，吸取 2.0ml于克氏培养瓶中，盖好瓶盖，放平 培养瓶，轻轻左右或前后晃动培养瓶使
细胞充分分散，做好标记，倒置显微镜 下观察，置于37℃ 5% CO2培养，放入培 养箱后拧松培养基瓶盖1/4圈，每天观察 细胞生长情况及培养液颜色变化，及时 更换培养液。
（五）结果