《食品安全快速检测技术》教学课件—07食品微生物快速检测技术
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L/O/G/O
模块六 食品微生物快速检测技术
学习目标
了解食品 微生物现 状及其卫 生学意义;
熟悉现代 检测技术 在食品微 生物检验 领域的应 用
掌握测试片 法对食品中 菌落总数、 大肠菌群、 金黄色葡萄 球菌的快速 检测方法。
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背景知识：
食品微生物 检测指标
菌落总数 大肠菌群 致病菌
• 注意事项 • 使用过的测试片上带有活菌，应及时按照生物安全废弃物
处理原则进行无害化处理。
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结果计算
• ①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算 两个平板菌落的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每克（或毫升）中菌落总数结果。
源自文库
• ②若两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下
• 常见的微生物快速检测方法： 免疫学技术 生化检测技术 基因芯片技术 仪器分析法
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项目一 菌落总数的快速检测
检测意义
• 食品中菌落总数的测定是用来判定食品被细菌污染程度的 一项指标，目的在于了解食品生产过程中，从原料加工到 成品包装受外界污染情况，可以应用这一现象观察细菌在 食品中繁殖的动态，确定食品的保质期，以便对被检样品 进行卫生学评价时提供依据。
各类食品有 限量标准
不得检出
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传统微生物检测方法与快速 测定技术比较
传统方法
快检技术
培养、分离、生化鉴定 分类、检测、鉴定、计数
费时费力、操作繁杂
不需准备、不需增菌
占用检测资源
缩短时间、方便携带
生产中不利于在线控制 操作简便易掌握
监管中反应不迅速
提高效率、现场即时检测
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• 操作步骤
• 1 ）样品稀释：把样品液摇匀，用1mL无菌吸管
或微量移液器吸取样品匀液1mL，注入含9mL灭菌 生理盐水的试管内，振荡试管或换用一支无菌吸管 反复吹打使其混合均匀，制成1:10的样品匀液。依 次类推，做出1:100等稀释度的稀释液，每个稀释 度更换一支灭菌吸管或吸头。
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• 2） 接种：根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适
宜稀释度的样品匀液进行检验（1：10000、1：100000）。 将测试片置于平坦实验台表面，揭开上层膜，用吸管或微 量移液器吸取1mL样品匀液，垂直滴加在测试片的中央， 将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜， 将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下， 使样液均匀覆盖于圆形的培养膜上，切勿扭转压板。拿起 压板，静止至少1min以使培养基凝固。每个稀释度接种两 张测试片。
检测意义 • 大肠菌群是一群能在36℃条件下培养48h发酵乳糖、产酸
产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 • 主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、克雷伯
氏菌和阴沟肠杆菌。 • 该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品
的卫生状况，推断食品受肠道致病菌污染的可能。
• 以GB/T4789.32-2002《食品卫生微生物学检验大肠菌 群的快速检测》作为参考。
• 细菌浓度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结 果记录为“多不可计”。
• 当细菌浓度很高时，测试片中央没有菌落，但圆形培养膜 的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多不可计”； 进一步稀释样品可获得准确的读数。
• 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象。 如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算菌 落数。
• 菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
• 目前已广泛应用并得到认可的是测试片快速检测法 • 以GB/T4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测
定》中第二法作为参考。
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一、测试片法
1、概况：
• 它是一项检测新方法，它是以纸片、冷水可凝胶和无纺布等作为培养基 载体来测定食品中微生物，最大优点是省却了繁重的准备工作，检样不 需要增菌，直接接种纸片，适宜温度培养后计数，使用后经灭菌便可弃 置，简单方便，缩短检测时间。方便携带，适于设备不足的基层实验室 和现场即时检测。有助于提高微生物实验质量和提高实验室效率。
列公式计算：
∑C
N= ————————————
• 式中： • N 样品中菌落数
(n1+0.1n2)×d
• ΣC 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和
• n1 第一个适宜稀释度的测试片数
• n2 第二个适宜稀释度的测试片数
• d 稀释因子(第一稀释度)
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项目二 大肠菌群的快速检测
• 以微生物专有酶快速反应作为理论依据。
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• 微生物专有酶快速反应： 是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特
异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，配制 在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变 化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌 的快速诊断。 • 这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来， 并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个 主要发展方向。
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主要仪器
恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、电子天平、均质器、 振荡器、微量移液器
• 试剂
①无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中， 121℃高压灭菌15min。 ②1mol/L氢氧化钠：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏 水。 ③1mol/L盐酸：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至 1000mL。
• 测试片目前在国内虽有生产厂家，但由于还没有相应生产标准，导致各 生产商间测试片质量参差不齐，检测结果不能得到普遍认同。较成熟的 测试片主要依靠进口，导致成本相对较高。
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• 适用范围 适用于各类食品中菌落总数的测定
• 检测原理 将培养基、凝胶和酶显色剂等加载在试纸片上，
经加样、培养后，细菌菌落在纸片上显现出红色菌 斑，通过计数报告结果。
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• 3）培养：将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内。
可堆叠至20片，36±1℃培养24h±2h。水产品30±1℃培养 72h±3h。
• 4）计数：培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或用
菌落计数器、放大镜。选取菌落数在30～300之间的测试 片计数。计数所有红色菌落。
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模块六 食品微生物快速检测技术
学习目标
了解食品 微生物现 状及其卫 生学意义;
熟悉现代 检测技术 在食品微 生物检验 领域的应 用
掌握测试片 法对食品中 菌落总数、 大肠菌群、 金黄色葡萄 球菌的快速 检测方法。
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背景知识：
食品微生物 检测指标
菌落总数 大肠菌群 致病菌
• 注意事项 • 使用过的测试片上带有活菌，应及时按照生物安全废弃物
处理原则进行无害化处理。
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结果计算
• ①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算 两个平板菌落的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每克（或毫升）中菌落总数结果。
源自文库
• ②若两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下
• 常见的微生物快速检测方法： 免疫学技术 生化检测技术 基因芯片技术 仪器分析法
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项目一 菌落总数的快速检测
检测意义
• 食品中菌落总数的测定是用来判定食品被细菌污染程度的 一项指标，目的在于了解食品生产过程中，从原料加工到 成品包装受外界污染情况，可以应用这一现象观察细菌在 食品中繁殖的动态，确定食品的保质期，以便对被检样品 进行卫生学评价时提供依据。
各类食品有 限量标准
不得检出
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传统微生物检测方法与快速 测定技术比较
传统方法
快检技术
培养、分离、生化鉴定 分类、检测、鉴定、计数
费时费力、操作繁杂
不需准备、不需增菌
占用检测资源
缩短时间、方便携带
生产中不利于在线控制 操作简便易掌握
监管中反应不迅速
提高效率、现场即时检测
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• 操作步骤
• 1 ）样品稀释：把样品液摇匀，用1mL无菌吸管
或微量移液器吸取样品匀液1mL，注入含9mL灭菌 生理盐水的试管内，振荡试管或换用一支无菌吸管 反复吹打使其混合均匀，制成1:10的样品匀液。依 次类推，做出1:100等稀释度的稀释液，每个稀释 度更换一支灭菌吸管或吸头。
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• 2） 接种：根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适
宜稀释度的样品匀液进行检验（1：10000、1：100000）。 将测试片置于平坦实验台表面，揭开上层膜，用吸管或微 量移液器吸取1mL样品匀液，垂直滴加在测试片的中央， 将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜， 将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下， 使样液均匀覆盖于圆形的培养膜上，切勿扭转压板。拿起 压板，静止至少1min以使培养基凝固。每个稀释度接种两 张测试片。
检测意义 • 大肠菌群是一群能在36℃条件下培养48h发酵乳糖、产酸
产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 • 主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、克雷伯
氏菌和阴沟肠杆菌。 • 该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品
的卫生状况，推断食品受肠道致病菌污染的可能。
• 以GB/T4789.32-2002《食品卫生微生物学检验大肠菌 群的快速检测》作为参考。
• 细菌浓度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结 果记录为“多不可计”。
• 当细菌浓度很高时，测试片中央没有菌落，但圆形培养膜 的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多不可计”； 进一步稀释样品可获得准确的读数。
• 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象。 如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算菌 落数。
• 菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
• 目前已广泛应用并得到认可的是测试片快速检测法 • 以GB/T4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测
定》中第二法作为参考。
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一、测试片法
1、概况：
• 它是一项检测新方法，它是以纸片、冷水可凝胶和无纺布等作为培养基 载体来测定食品中微生物，最大优点是省却了繁重的准备工作，检样不 需要增菌，直接接种纸片，适宜温度培养后计数，使用后经灭菌便可弃 置，简单方便，缩短检测时间。方便携带，适于设备不足的基层实验室 和现场即时检测。有助于提高微生物实验质量和提高实验室效率。
列公式计算：
∑C
N= ————————————
• 式中： • N 样品中菌落数
(n1+0.1n2)×d
• ΣC 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和
• n1 第一个适宜稀释度的测试片数
• n2 第二个适宜稀释度的测试片数
• d 稀释因子(第一稀释度)
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项目二 大肠菌群的快速检测
• 以微生物专有酶快速反应作为理论依据。
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• 微生物专有酶快速反应： 是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特
异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，配制 在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变 化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌 的快速诊断。 • 这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来， 并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个 主要发展方向。
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主要仪器
恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、电子天平、均质器、 振荡器、微量移液器
• 试剂
①无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中， 121℃高压灭菌15min。 ②1mol/L氢氧化钠：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏 水。 ③1mol/L盐酸：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至 1000mL。
• 测试片目前在国内虽有生产厂家，但由于还没有相应生产标准，导致各 生产商间测试片质量参差不齐，检测结果不能得到普遍认同。较成熟的 测试片主要依靠进口，导致成本相对较高。
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• 适用范围 适用于各类食品中菌落总数的测定
• 检测原理 将培养基、凝胶和酶显色剂等加载在试纸片上，
经加样、培养后，细菌菌落在纸片上显现出红色菌 斑，通过计数报告结果。
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• 3）培养：将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内。
可堆叠至20片，36±1℃培养24h±2h。水产品30±1℃培养 72h±3h。
• 4）计数：培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或用
菌落计数器、放大镜。选取菌落数在30～300之间的测试 片计数。计数所有红色菌落。
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