ELISA原理、方法、操作及影响因素

二、酶免疫测定操作步骤
（一）标本的收集、运送和保存 （二）试剂准备 （三）加样 （四）温育 （五）洗板 （六）显色 （七）比色 （八）结果判读
操作示意图
（一）标本的收集、运送和保存
ELISA法中主要以血清为标本，血清标本按常规方法采集，应注意 避免溶血，因红细胞溶解释放出的具有过氧化物酶活性的物质对结 果有影响。
一、原理
（二）ELISA原理 1） ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗 原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性
2）在测定时，受检标本（测定其中的抗原或抗体）与固相载体表 面的抗原或抗体反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与液体中其他物质分开
3）在加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上， 此时固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例
4）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量 与标本中受检物质的量直接相关，则可根据颜色的深浅进行定性或 定量分析
5）在ELISA方法中有三个必要试剂 ①固相载体的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” ②酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” ③酶反应的底物，即“显色剂”
（二）试剂准备
三个必备试剂： 1）固相抗原或抗体 2）酶标抗原或抗体 3）酶反应底物
（三）加样
在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物。 在加入血清标本后，可在微型振荡器上振荡1分钟以保证混匀，加 入酶结合物时，应使加液过程迅速完成。
（四）温育
目前常用的温育时间和温度为37℃ 30分钟—1小时，温育时间过短 或温度不够可影响反应物结合，从而影响结果
四、影响ELISA测定的因素
（一）试剂盒的因素 （二）标本的因素 （三）实验操作的因素
（一）试剂盒的因素
1）固相材料：聚苯乙烯塑料
2）抗原：纯化、合成和基因工程抗原
3）抗体：多抗、单抗和基因工程抗体
（一）试剂盒的因素
4）酶结合物：酶免疫测定的核心成分 5）色原底物：OPD和TMB 6）运输贮存
（二）抗体测定
①间接法
1）将抗原包被在固相载体上，加入待测样本，使样本中待测抗体 与固相载体上的抗原结合，加入酶标二抗（抗抗体物），在固相载 体上形成固相抗原—待测抗体—酶标抗抗体复合物，加入底物显色 2）常用于：丙型肝炎抗体、人免疫缺陷病毒抗体等
（二）抗体测定
②双抗来自百度文库夹心法
1）双抗原夹心法适用于大分子抗体 2）形成固相抗原—待测抗体—酶标抗原复合物 3）常用于测定乙型肝炎表面抗体等
4）“边缘效应”的排除
③洗板
1）每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系
2）洗液一般为含0.05%吐温的中性PBS（磷酸盐缓冲液）
3）洗板液中吐温浓度高于0.2%，可使包被于固相载体上的抗原或 抗体解吸附而影响试验测定下限
④显色
1）加入底物A和B后，应振荡混匀
2）当底物为OPD时，显色反应应避光进行
（五）洗板
保证每孔都被洗到，ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原 抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的干扰 物质清除掉
（六）显色
一般显色时间并非试剂盒规定的时间，因为试剂盒的吸光度值会受 环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触的物品等有关，实验操 作人员在加完显色液后，可根据颜色深浅适当延长或缩短显色时间
3）一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15—30min，从 理论上说，37℃30min才可以使HRP的底物催化反应完全，在最初 的10min内，绝大多数催化反应即可完成。
（二）抗体测定
③竞争法
1）主要针对小分子抗体 2)先将抗原包被固相载体上，然后同时加入待测抗体和酶标抗体， 待测抗体与酶标抗体竞争与固相抗体结合，温育、洗涤加入酶底物 显色，显色颜色深浅与待测抗体成负相关。 3）常用于测定乙肝核心抗体、乙肝e抗体
（二）抗体测定
④捕获法
1）主要用于血清中某种抗体亚型（如lgG、lgM、lgA)成分的测定， 目前最常用的是病原性感染诊断中的lgM型抗体
（七）比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后正确放入酶 标比色仪中。
三、抗原和抗体的检测方法
（一）抗原测定：双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法
（二）抗体测定：间接法 双抗原夹心法 竞争法 捕获法
（一）抗原测定
①双抗体夹心法
1）双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的大分子抗原的测定 2）形成固相抗体—待测抗原—酶标抗体复合物 3）常用于：乙肝表面抗原、甲胎蛋白、HCG等检测
（二）标本的因素
1）内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗 体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等
2）外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固 不全、反复冻融
（三）实验操作因素
（三）实验操作的因素
①加样
1）加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可贱出和产生气泡。
（一）抗原测定
②双位点一步法
1）针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克 隆抗体，即包被使用一种单克隆抗体，酶标使用另外一种单克隆抗 体，两种抗体互不干扰。
（一）抗原测定
③竞争法
1）主要用于检测小分子抗原 2）先将抗体包被固相载体上，然后同时加入待测抗原和酶标抗原， 待测抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，温育、洗涤加入酶底物 显色 3）显色颜色深浅与待测抗原成负相关
酶联免疫吸附试验
（ELISA)
主要内容
一、原理 二、酶免疫测定操作步骤 三、抗原、抗体的检测方法 四、影响ELISA测定的因素
一、原理
（一）酶免疫技术简介 • 1971年由瑞典学者Engra11和Per1mann,荷兰学者Vanweeman和
Schuurs报道。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物 质测定的实验方法。
2）从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重 要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样 就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色
②温育
1）常采用的温育温度有43℃、37℃、室温和4℃等
2）温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对 较短
3）温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应 溶液的温度迅速与温育温度平衡