10种中药提取物对耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究_李伟奇

表 1 金黄色葡萄球菌耐药谱
Table 1 The spect ru m of St aph ylococcus aur eus resi st an t t o f luoroquinolones
药物 D rug s
环丙沙星 Cip rof loxacin 氧氟沙星 O f loxacin 恩诺沙星 N rofl oxaci n 诺氟沙星 N orfl oxaci n
2 结果
2 .1 10 种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄 色葡萄球菌的体外抑菌效果 2 .1 .1 抑菌圈直径测定结果 10 种中药水提取液 对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌不同菌株的抑 菌圈直径见表 2 , 结果表明 , 黄芩对 5 种耐氟喹诺酮 类药物金黄色 葡萄球菌 不同菌株 体外抑制 作用最 强 , 其次是艾叶 、马兜铃等 , 半夏作用最弱 。 2 .1 .2 M IC 测定结果 10 种中药水提取液对耐氟 喹诺酮类药物金黄色葡萄 球菌的 M IC 测定结果见 表 3 , 结果表明 , 黄芩对 5 种耐氟喹诺酮类药物金黄 色葡萄球菌的 M IC 最低 , 说明其抑 菌作用最强 , 其 次是艾叶 、罗汉果等 , 半夏最大 。同 时 , 同一药物对 不同菌株的 MIC 不同 。
1 材料与方法
1 .1 材料 1 .1 .1 试验菌株 耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄 球菌(Sa1 、Sa2 、Sa3 、Sa4 、Sa5)均由中国农业大学提 供 , 其 M IC 值 见 表 1 ;金 黄 色 葡 萄 球 菌 标 准 菌 AT CC25923(Sa)由湖南农业大学动物 医学院基础 兽医实验室提供 。
药敏纸片法[ 14] 。 试验用金黄色葡萄球菌在含亚 抑菌浓度中药 LB 培养基中培养 24 h , 取出少量稀释 (约 1 000 倍 , 以获得薄层菌苔为宜)后每个平板培养 基涂布 0 .1 m L , 待培养基表面干燥后将药敏纸片贴 于培养基表面 , 37 ℃培养 18 h 观察 。 1 .2 .7 数 据分析 试 验数据均采用 SPSS13 .0 和 Excel 2003 进行数据统计 、方差分析和 t 检验 。
中图分类号 :S859.3
文献标识码 :A
文章编号 :1007-5038(2010)09-0041-05
随着抗菌药物在临床医学上的广泛应用 , 细菌 对抗菌药物的耐药问题日趋严重 , 其耐药水平越来 越高 , 出现了多重耐药菌株 , 给人类和动植物的健康 带来极大的危害 , 细菌耐药性问题已经成为全球关 注的一个热点[ 1-2] 。 由于耐药性是细菌在不良生存 环境下产生的本能生理反应 , 是适应环境维持生命 所必需的特性 , 因而不管研制什么样的新一代药物 都不可能完全避免细菌耐药性的产生[ 3] 。 为此 , 研 究耐药性抑制剂 , 关系到人类和动植物的健康 。 近 年来 , 世界各国除继续致力于筛选对耐药菌有效且 具有新抗菌谱 、新作用机制的抗生素之外 , 还开始寻 找能够提高抗 生素效能 、颉颃细菌 耐药性的 物质 。 已有研究显示 , 一些化学试剂虽有逆转多重耐药的 功效 , 但因其具有较大的毒副作用 , 使临床应用受到
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动物医学进展 2010 年 第 31 卷 第 9 期(总第 207 期)
1 .2 方法 1 .2 .1 菌液的制备 耐药金黄色葡萄球菌用营养 琼脂培养基平板 37 ℃培养 18 h ～ 24 h , 挑选典型菌 落接种于肉汤中 , 再经 37 ℃肉汤培养 18 h 后 , 将菌 液稀释至 105 ～ 106 个菌/ m L 备用[ 4-5] 。 1 .2 .2 中药水提物的制备 10 种中药水提取液的 制备[ 8-9] :药物与水以 1 ∶10 比例浸泡 24 h , 80 ℃中 回流提取 2 h , 过滤 ;滤渣再加 5 倍量体积水回流提 取 2 h , 过滤 ;合并滤液 , 浓缩至含生药 1 g/ mL[ 6-7] 。 1 .2 .3 药敏纸片法 取含生药 1 g/ mL 的中药水提 液溶液 1 .5 m L , 放入直径为 6 mm 的灭菌滤纸片(10 片为 1 组)50 片 , 浸泡 2 h 。 待其自然干燥后 , 用紫外 线照射灭菌 10 min ～ 15 min 。取灭菌后的琼脂培养 基 15 mL , 倒入已灭菌的平皿内 , 使其厚度为 4 mm , 待冷却凝固后 , 每个平皿划分为 4 区 , 用移液枪吸取 0 .1 m L 菌液于平皿内 , 用玻棒铺匀 , 然后贴上含有 药液的纸片 , 置 37 ℃培养箱中培养 24 h , 用游标直 尺测定抑菌圈直径 , 取平均值 , 判定按 NCC LS 2008 年标准进行[ 10] 。 1 .2 .4 最小抑菌浓度(M IC)的测定 参照 NCC LS 推荐的微量稀释法(micro dilutio n method)进行 。相 同过程重复 3 次 。
13 .5 ±0 .4 (P <0 .05)
15 .9 ±0 .5
马兜铃 Fructu s A ri st olochiae
14 .6 ±0 .3 (P <0 .05)
16 .4 ±0 .4 (P <0 .05)
14 .1 ±0 .3 (P >0 .05)
15 .8 ±0 .3 (P <0 .05)
S a5
18 .6 ±1 .6 (P <0 .05)
Sa 20 .8 ±0 .4
艾叶 Foli a A rt emi siae A rgyi
15 .5 ±0 .6 (P >0 .05)
14 .0 ±0 .2 (P <0 .05)
13 .9 ±0 .5 (P <0 .05)
14 .2 ±0 .3 (P <0 .05)
动物医学进展 , 2010 , 31(9):41-46 P rogress in Vet eri nary Medicine
＊
10 种中药提取物对耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究
李伟奇1, 2 , 刘湘新3 , 李俊超3 , 贺建华1, 2＊
(1 .湖南农业大学食品科 技学院 , 湖南长沙 410128;2.湖南农业大学动物科技学院 , 湖南长沙 410128 ; 3 .湖南农业大学动物医学 院 , 湖南长沙 410128)
试管法[ 11] :中药提取液由于颜色太深 , 难于直观 判定 。因此用葡萄糖酚红液体培养基代替普通培养 基 。 取 60 支灭菌带棉塞的试管 , 每 12 支为一组 , 编 号 。 在超净台上每支试管内分别加入葡萄糖酚红肉 汤培养基 1 .0 m L 。 将配制药液作二倍递减浓度稀 释(即 1 ～ 10 号试管内药物浓度依次为 0 .5 、0 .25 、 0 .125 、0 .062 5 、0 .030 8 、0 .016 、0 .008 、0 .004 、0 .002 和 0 .001 g/ m L)。 然后在 1 号 ～ 10 号试管每管分别 加入菌液 0 .1 m L , 第 11 号试 管只加 肉 汤和 药液 1 mL , 不加菌液, 作为对照, 观察药物是否污染, 第 12 号试管加葡 萄糖 酚红液 体培养 基1 .0 m L , 菌液 0 .1 m L , 作为细 菌对 照 , 观 察细 菌是 否正 常生 长 。 然后将 试验管 和对 照管置 37 ℃的 培养 箱中 培养 24 h后取出 , 观察并判 定药物对此菌株的最低抑菌 浓度(M I C)。 1 .2 .5 最低杀菌浓度(M BC)的测定 金色葡萄球 菌发酵葡萄糖产酸 , 有细菌生长的酚红指示剂变为 黄色 , 药液透明管直接判读[ 12-13] 。凡是色泽深暗管 ,
13 .2 ±0 .7 (P >0 .05)
16 .6 ±0 .2
细辛 A siasarum
13 .9 ±0 .5 (P >0 .05)
14 .7 ±0 .2 (P >0 .05)
13 .7 ±0 .2 (P <0 .05)
mm
药液 M edi cine ext ract s
黄芩 Scu tellaria
Sa1
19 .6 ±0 .5 (P >0 .05)
S a2
20 .7 ±1 .7 (P >0 .05)
菌株 St rai n
Sa3
Sa4
18 .6 ±0 .9 (P <0 .05)
20 .5 ±1 .2 (P >0 .05)
李伟奇等 :10 种中药提取物对耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究
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表 2 10 种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌 5 种株型的抑菌圈直径 Table 2 The Bact erios tasis ci rcle diameters of w ater ext ract s of 10 ki nds t radi tional Chinese medicine to resi st an t f luoroquinolones S .aur eus
摘 要 :为了解研究中药提取物对耐药菌的抑菌作用 , 采用纸片法和倍比稀释法研究 10 种中药水提取液 对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用 ;用点种法和药敏纸片法研究耐药抑转作用 。结果显示 , 10 种中药水提物中黄芩水提取物对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌抑制效果最明显 。耐药性抑制试验结果 表明 , 只有黄芩水提取物对 Sa1 的耐药性有明显的抑制作用 , 抑制率达 65 %, 但对其他菌株的抑制作用则表现 不明显 ;药敏纸片法显示黄芩对细菌耐药性有最强抑制作用 。 表明中药水提取物对耐氟喹诺酮类药物金黄色 葡萄球菌有抑制作用 , 且部分药物抑菌作用明显 ;黄芩水提取物对 Sa1 菌株具有耐药逆转作用 。 关键词 :水提取物 ;耐药金色葡萄球菌 ;体外抑菌试验 ;中药
在培养 24 h 后用移液器分别吸取 0 .1 m L 培养物 , 移种于不含药的普通营养琼脂上 , 轻轻推开药液 , 置 37 ℃培养过夜 。观察有无细菌生长 , 按一般规定 , 平 皿培养基中 , 计数应少于 5 个菌落者作为该药物的 最低杀菌浓度(MBC);反之 , 无细菌生长各试验管培 养物 , 经移种于 平皿培养基后 , 各浓度均 有细菌生 长 , 该药物为抑菌作用无效 。 1 .2 .6 耐药性抑制试验测定 采用平板点种法[ 3] 。 将试验用耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌(Sa1 、 S a2 、Sa3 、Sa4 、Sa5)分别在不含药物和含亚抑菌浓度 的中药水提取液的 LB 液体培养基中培养 24 h , 取出 少量菌液经稀释后(OD 在 0 .3 ～ 0 .5 之间)涂布于普 通琼脂培养基上培养 , 16 h 后获得大量单个菌落 , 选 取 200 个单个菌落 , 然后一一对应 , 将单个菌落点种 于含亚抑菌浓 度环丙沙星的琼脂培养基 , 培养18 h ～ 20 h , 观察并依据公式计算耐 药菌抑制率 。 抑制 率 =(点种菌落数-药物平板生长菌落数)/ 点种菌落 数。
限制[ 3] 。从 20 世纪 90 年代至今 , 相关研究报道表 明[ 2] , 某些中药具有逆转耐药性的作用 , 因此 , 从我 国天然 、低毒的中药中筛选耐药抑制剂 , 成为人们关 注的热点 。本试验在前人研究的基础上 , 探讨了 10 种中药对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑制作用和耐 药逆转作用 , 以期为中药耐药抑制剂的研究开发提 供一定的理论基础 。
Sa1 128 32
4 >128
菌株 来自百度文库t rain
S a2
Sa3
Sa4
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16
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μg/ m L
Sa5 16 8 4 32
1 .1 .2 药品 黄芩 、艾叶 、细辛等中药购自长沙养 物药厂 。 天和大药房 ;环丙沙星原料药购自湖南农业大学动
＊收稿日期 :2010-02-25 基金项目 :国际科技合作计划项目(2009DFA 32350);国家科技支撑计划项目(2007BA Q 01047) 作者简介 :李伟奇(1985 -), 男 , 湖南长沙人 , 硕士研究生 , 主要从事动物营养与健康研究 。 ＊通讯作者