06电泳-蛋白质电泳技术-to S
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2011-11-7 13
6.1.3 电泳技术的分类
原则上按电泳的分离原理来分。可分为三类： 自由移动界面电泳
纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 淀粉凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳
14
区带电泳
稳态电泳（等电聚焦，等速电泳）
2011-11-7
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
纸电泳（Paper electrophoresis）； 醋酸纤维素薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）； 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）； SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
V=J
E大，V快； K大，V小。
2011-11-7
25
2011-11-7
26
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.5 凝胶电泳的支持介质
为什么要用支持介质？
抗对流；抗扩散。
6.1.5 凝胶电泳的支持介质
按支持介质的不同把电泳技术分五类：
2011-11-7 3
6.1.1 电泳技术的发展
o1909 Michaelis 测定了酶的等电点和胶体粒子在电泳中的迁移， 并将这种迁移命名为 “电泳” o1912－1915 Ellis, Powis 观察电泳迁移 o1923－1924 Svedlberg 对电泳过程的白蛋白进行荧光照相 o1934 Ab Abramson 研究了膜蛋白的尺寸、形状对电迁移的影响 oSvedlberg & Tiselius 又使用光学方法观察白蛋白的电迁移过程， 直接测量感光板上电泳带的迁移距离。 1937 Tiselius 利用“shadow 阴影照相法”观察到电场中蛋白 质界面的移动，并证明了血清是由白蛋白、 1、2、和 球蛋 白组成——称为 “移界电泳法” ——moving boundary EP
2011-11-7 5
标准电泳迁移
2011-11-7
边缘溶剂蒸发效应
6
1
2011-11-7
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
自由溶液中电泳，分离效率受热扩散和对流限制。 1979 Everaerts & Mikker 等证实了用毛细管来抑制对流和增 强散热效果，以提高分离效率。 使用200 m 内径聚四氟乙烯管，UV检测器，分离了16 种有机酸，理论塔板数达到18万/米。这是毛细管电泳 发展史上的一个重大突破。
微流控芯片
1981 这是毛细管电泳发展史上的里程碑。 1988
2011-11-7
毛细管电泳商品仪器推出
9 2011-11-7 10
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
普通电泳与毛细管电泳的异同
相同点：电泳基本理论 不同点：使用细内径毛细管，抑制了对流和减小热扩散； 分析速度快； 样品进样量少(pL~nL)； 试剂消耗量少； 可实现在线检测，自动化程度高；
6.1.3 电泳技术的分类
按电场分：常压（<500V，适用大分子）；高压
（>500V， 1kV5kV，适用小分子）；超高压（ 30kV50kV ，毛细管 电泳）
按有无支持介质分：自由电泳、支持物电泳； 按仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式。
2011-11-7
11
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12
2
2011-11-7
2011-11-7
电泳条带
15
2011-11-7
16
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4 电泳基本理论
6.1.4.1 粒子的移动速度（泳动速度V）
带电颗粒放在一个没有干扰的电场中，颗粒恒定迁 移速率的动力 介质的摩擦阻力f抗衡。
当F引=F阻时
2011-11-7 22
离子氛示意图
2011-11-7
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4.4 电渗流—毛细管电泳中的驱动力
电渗流 Electroosmotic flow (EOF)
电渗现象：外加电场作用下，与固体支持物接触的液体层
发生移动的现象。 电渗流：电渗现象中液体的整体流动。
电泳技术：利用电泳现象对某些化学或生
物化学物质进行分离分析的技术；
2011-11-7 1
电泳仪：完成电泳分离的仪器。 2011-11-7
2
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.1 电泳技术的发展
1809年，俄国物理学家Von Reus首次发现黏土颗粒的电迁移现象 第一次电泳试验 1816年， Porrett 首次实验荷电的动物膜蛋白； 1861年， Quincke 证实带电颗粒的迁移与电位梯度成线性关系； 1879年， Helmholts 用公式计算颗粒表面的电荷分布； 1892－1897 Picton & Linder 首先使用V型槽和U型管槽； 1899年，Hardy 揭示了颗粒的两性表面和卵蛋白的等电点； 1903年，Smoluchowski用公式计算颗粒表面的电荷分布。 1907年， Field和Teagua 用电泳理论作指导，研究设计出填充有 琼脂糖凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。 ——把电泳作为一种分离分析技术。
27 2011-11-7
薄膜类
支持介质应具备哪些特性？
物理化学性质稳定； 化学惰性； 电内渗小。
2011-11-7
琼脂糖凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis）；
凝 胶 类
28
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
EQ= 6πrη EQ V= 6 πrη
（ 3） （ 4）
电荷引力： 在自由溶液中,运动粒子与溶液间阻力F阻：
F阻=6πrη （ 2） F引=E Q （ 1）
粒子的移动速度(泳动速度)与电场强度(E)、粒子
所带电荷量(Q)成正比，而与粒子半径(r)及溶液粘度(η) 成反比。
非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更
6.1.5 凝胶电泳的支持介质 两大类支持介质的特点
化学惰性好，能将对流减到最小； 薄膜类 分离主要原理：生物大分子的电荷密度！
聚丙烯酰胺凝胶及其合成
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.3 电泳技术的分类
按支持介质的不同可分为： ⑴ 纸电泳（Paper electrophorisis） ⑵ 醋酸纤维素薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis p ） ⑶ 琼脂糖凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） ⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳 ； ⑶ 柱电泳 ；(4) U型
2011-11-7
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
生物分析化学
电泳——Electrophoresis，EP ——蛋白质电泳技术
§6-1 电泳概论
电泳：电泳是指带电粒子在电场的作用下发 生定向迁移的过程。电泳定义动画 电泳定义动画 不同粒子因大小和所带电荷量及性质的不 同，以不同速度迁移而得到分离。
是毛细管电泳分离的主要驱动力，是毛细管中的溶剂因轴向直流 电场作用发生的定向流动。其大小直接影响分析结果的精确度， 准确度。
电渗流的大小用电渗流速度Veof表示
Veof= eof E
eof= /4 ＋
-
：电泳介质电解常数；
：电泳介质粘度 ;
：毛细管壁的zeta 电位； E：电场强度。
2011-11-7 8
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
80年代初轰动分离科学界的实验
1981年 Jorgenson和Luckas 在170m内径的毛细管中填充了10 m粒径的 Partisil ODS-2填 料，在电场作用下成功地分离了多环芳烃，柱效高达31000理论 塔板数，这是电色谱的雏形。 毛细管电泳 毛细管电色谱 毛细管开管电泳 毛细管涂层电泳
b. 1902 d. 1971
如何降低焦 耳热？
"for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteins"
24
2011-11-7
23
2011-11-7
4
2011-11-7
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
如何控制毛细管电泳中的电渗流？ 在低pH下电泳； 进行化学表面修饰； 对毛细管壁进行动态涂层； 使用添加剂改变溶液的粘度或电势。
6.1.4.5 带电颗粒的V与E、J、K关系
大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。
17 2011-11-7 18
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3
2011-11-7
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4.2电泳迁移率（/泳动度/淌度）—Mobility 电泳迁移率（/泳动度/淌度）：带电颗粒在
使用抗对流介质（纸，凝胶作为支持介质）克服对流。 1960－1962 纸电泳，琼脂电泳，淀粉凝胶电泳 1963－1966 高压纸电泳 Tiselius电泳 1966－1970 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)
只能在低电场强度下进行电泳以克服自 由溶液电泳的焦耳热？？？
2011-11-7 7
该工作实际上是毛细管电泳的开创性工作。 由于检测器灵敏度的限制，进样量大，导致峰形 不好，没有引起人们的重视。
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4 电泳基本理论
+
6.1.4 电泳基本理论
生物大分子的电荷来源：
-
COOCOOCOOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH╲ ╲ + OHNH3+ NH3+ NH2 pH>pI pH=pI pH<pI
单位电场强度下的移动速度。
6.1.4.3 影响电泳迁移率（泳动度）的因素 影响的因素：
颗粒本身：带电、大小、形状
= /E = Q/6πrη
（5）
迁移率—物理化学特性常数。 生物大分子的净电荷取决于环境的pH。
2011-11-7 19 2011-11-7
电场强度E： 一定时，E高， 快 溶液因素：pH、离子强度I、电渗、缓 冲液粘度及温度等。
20
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4.3 影响电泳迁移率（泳动度）的因素
1. 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子 带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移 速度越快； 2. 缓冲液p pH和离子强度：p pH值距p pI愈远，Q越大，V越大 ；
6.1.4.3 影响电泳迁移率（泳动度）的因素
3. 电场强度：E高，带电颗粒泳动快。过高;过低。当需要增大 电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置；
4. 电渗 ：在 电场中液体对固体支持物的相对移动；电渗方向与 电泳方向； 5. 支持介质：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力 也就越大；介质的纯度影响聚焦效果；介质的非特异性吸附会 增大电渗。
2011-11-7 4
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.1 电泳技术的发展
The Nobel Prize in Chemistry 1948
电泳影响因素——焦耳热，扩散
影响电泳分离的因素 实际电泳过程中的其它因素
焦耳热：电场的使用和产生的电流，会产生焦耳热， 使系统的温度增加。Q=I2·R·t
6.1.3 电泳技术的分类
原则上按电泳的分离原理来分。可分为三类： 自由移动界面电泳
纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 淀粉凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳
14
区带电泳
稳态电泳（等电聚焦，等速电泳）
2011-11-7
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纸电泳（Paper electrophoresis）； 醋酸纤维素薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）； 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）； SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
V=J
E大，V快； K大，V小。
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北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.5 凝胶电泳的支持介质
为什么要用支持介质？
抗对流；抗扩散。
6.1.5 凝胶电泳的支持介质
按支持介质的不同把电泳技术分五类：
2011-11-7 3
6.1.1 电泳技术的发展
o1909 Michaelis 测定了酶的等电点和胶体粒子在电泳中的迁移， 并将这种迁移命名为 “电泳” o1912－1915 Ellis, Powis 观察电泳迁移 o1923－1924 Svedlberg 对电泳过程的白蛋白进行荧光照相 o1934 Ab Abramson 研究了膜蛋白的尺寸、形状对电迁移的影响 oSvedlberg & Tiselius 又使用光学方法观察白蛋白的电迁移过程， 直接测量感光板上电泳带的迁移距离。 1937 Tiselius 利用“shadow 阴影照相法”观察到电场中蛋白 质界面的移动，并证明了血清是由白蛋白、 1、2、和 球蛋 白组成——称为 “移界电泳法” ——moving boundary EP
2011-11-7 5
标准电泳迁移
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边缘溶剂蒸发效应
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自由溶液中电泳，分离效率受热扩散和对流限制。 1979 Everaerts & Mikker 等证实了用毛细管来抑制对流和增 强散热效果，以提高分离效率。 使用200 m 内径聚四氟乙烯管，UV检测器，分离了16 种有机酸，理论塔板数达到18万/米。这是毛细管电泳 发展史上的一个重大突破。
微流控芯片
1981 这是毛细管电泳发展史上的里程碑。 1988
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毛细管电泳商品仪器推出
9 2011-11-7 10
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北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
普通电泳与毛细管电泳的异同
相同点：电泳基本理论 不同点：使用细内径毛细管，抑制了对流和减小热扩散； 分析速度快； 样品进样量少(pL~nL)； 试剂消耗量少； 可实现在线检测，自动化程度高；
6.1.3 电泳技术的分类
按电场分：常压（<500V，适用大分子）；高压
（>500V， 1kV5kV，适用小分子）；超高压（ 30kV50kV ，毛细管 电泳）
按有无支持介质分：自由电泳、支持物电泳； 按仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式。
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电泳条带
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6.1.4 电泳基本理论
6.1.4.1 粒子的移动速度（泳动速度V）
带电颗粒放在一个没有干扰的电场中，颗粒恒定迁 移速率的动力 介质的摩擦阻力f抗衡。
当F引=F阻时
2011-11-7 22
离子氛示意图
2011-11-7
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6.1.4.4 电渗流—毛细管电泳中的驱动力
电渗流 Electroosmotic flow (EOF)
电渗现象：外加电场作用下，与固体支持物接触的液体层
发生移动的现象。 电渗流：电渗现象中液体的整体流动。
电泳技术：利用电泳现象对某些化学或生
物化学物质进行分离分析的技术；
2011-11-7 1
电泳仪：完成电泳分离的仪器。 2011-11-7
2
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北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.1 电泳技术的发展
1809年，俄国物理学家Von Reus首次发现黏土颗粒的电迁移现象 第一次电泳试验 1816年， Porrett 首次实验荷电的动物膜蛋白； 1861年， Quincke 证实带电颗粒的迁移与电位梯度成线性关系； 1879年， Helmholts 用公式计算颗粒表面的电荷分布； 1892－1897 Picton & Linder 首先使用V型槽和U型管槽； 1899年，Hardy 揭示了颗粒的两性表面和卵蛋白的等电点； 1903年，Smoluchowski用公式计算颗粒表面的电荷分布。 1907年， Field和Teagua 用电泳理论作指导，研究设计出填充有 琼脂糖凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。 ——把电泳作为一种分离分析技术。
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薄膜类
支持介质应具备哪些特性？
物理化学性质稳定； 化学惰性； 电内渗小。
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琼脂糖凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis）；
凝 胶 类
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EQ= 6πrη EQ V= 6 πrη
（ 3） （ 4）
电荷引力： 在自由溶液中,运动粒子与溶液间阻力F阻：
F阻=6πrη （ 2） F引=E Q （ 1）
粒子的移动速度(泳动速度)与电场强度(E)、粒子
所带电荷量(Q)成正比，而与粒子半径(r)及溶液粘度(η) 成反比。
非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更
6.1.5 凝胶电泳的支持介质 两大类支持介质的特点
化学惰性好，能将对流减到最小； 薄膜类 分离主要原理：生物大分子的电荷密度！
聚丙烯酰胺凝胶及其合成
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.3 电泳技术的分类
按支持介质的不同可分为： ⑴ 纸电泳（Paper electrophorisis） ⑵ 醋酸纤维素薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis p ） ⑶ 琼脂糖凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） ⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳 ； ⑶ 柱电泳 ；(4) U型
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生物分析化学
电泳——Electrophoresis，EP ——蛋白质电泳技术
§6-1 电泳概论
电泳：电泳是指带电粒子在电场的作用下发 生定向迁移的过程。电泳定义动画 电泳定义动画 不同粒子因大小和所带电荷量及性质的不 同，以不同速度迁移而得到分离。
是毛细管电泳分离的主要驱动力，是毛细管中的溶剂因轴向直流 电场作用发生的定向流动。其大小直接影响分析结果的精确度， 准确度。
电渗流的大小用电渗流速度Veof表示
Veof= eof E
eof= /4 ＋
-
：电泳介质电解常数；
：电泳介质粘度 ;
：毛细管壁的zeta 电位； E：电场强度。
2011-11-7 8
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80年代初轰动分离科学界的实验
1981年 Jorgenson和Luckas 在170m内径的毛细管中填充了10 m粒径的 Partisil ODS-2填 料，在电场作用下成功地分离了多环芳烃，柱效高达31000理论 塔板数，这是电色谱的雏形。 毛细管电泳 毛细管电色谱 毛细管开管电泳 毛细管涂层电泳
b. 1902 d. 1971
如何降低焦 耳热？
"for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteins"
24
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2011-11-7
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如何控制毛细管电泳中的电渗流？ 在低pH下电泳； 进行化学表面修饰； 对毛细管壁进行动态涂层； 使用添加剂改变溶液的粘度或电势。
6.1.4.5 带电颗粒的V与E、J、K关系
大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。
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北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4.2电泳迁移率（/泳动度/淌度）—Mobility 电泳迁移率（/泳动度/淌度）：带电颗粒在
使用抗对流介质（纸，凝胶作为支持介质）克服对流。 1960－1962 纸电泳，琼脂电泳，淀粉凝胶电泳 1963－1966 高压纸电泳 Tiselius电泳 1966－1970 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)
只能在低电场强度下进行电泳以克服自 由溶液电泳的焦耳热？？？
2011-11-7 7
该工作实际上是毛细管电泳的开创性工作。 由于检测器灵敏度的限制，进样量大，导致峰形 不好，没有引起人们的重视。
北京理工大学生命科学与技术学院 生物分析化学
6.1.4 电泳基本理论
+
6.1.4 电泳基本理论
生物大分子的电荷来源：
-
COOCOOCOOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH╲ ╲ + OHNH3+ NH3+ NH2 pH>pI pH=pI pH<pI
单位电场强度下的移动速度。
6.1.4.3 影响电泳迁移率（泳动度）的因素 影响的因素：
颗粒本身：带电、大小、形状
= /E = Q/6πrη
（5）
迁移率—物理化学特性常数。 生物大分子的净电荷取决于环境的pH。
2011-11-7 19 2011-11-7
电场强度E： 一定时，E高， 快 溶液因素：pH、离子强度I、电渗、缓 冲液粘度及温度等。
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6.1.4.3 影响电泳迁移率（泳动度）的因素
1. 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子 带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移 速度越快； 2. 缓冲液p pH和离子强度：p pH值距p pI愈远，Q越大，V越大 ；
6.1.4.3 影响电泳迁移率（泳动度）的因素
3. 电场强度：E高，带电颗粒泳动快。过高;过低。当需要增大 电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置；
4. 电渗 ：在 电场中液体对固体支持物的相对移动；电渗方向与 电泳方向； 5. 支持介质：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力 也就越大；介质的纯度影响聚焦效果；介质的非特异性吸附会 增大电渗。
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6.1.1 电泳技术的发展
The Nobel Prize in Chemistry 1948
电泳影响因素——焦耳热，扩散
影响电泳分离的因素 实际电泳过程中的其它因素
焦耳热：电场的使用和产生的电流，会产生焦耳热， 使系统的温度增加。Q=I2·R·t