黄酮的提取 三种方法

辣木叶中黄酮的提取具体操作流程
1.1材料与试剂
辣木叶，老师提供；芦丁标准品、分析纯无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝，氢氧化钠等。

1.2仪器与设备
KQ-300DE型数控超声波清洗器；电子分析天平；AnkeTDL-5-A离心机；紫外/可见分光光度计。

1.3辣木叶总黄酮的提取方法
取干燥的辣木叶，粉碎过40目筛。

准确称取辣木叶粉1.0g，置于100mL烧杯中，加入体积分数为80%的乙醇溶液超声提取，提取液离心分离，测定总黄酮的含量。

具体操作流程：辣木叶→干燥→磨粉→过40目筛→超声提取→离心→上清液→测定总黄酮含量。

1.4总黄酮的测定方法
1.4.1芦丁标准曲线的绘制
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用体积分数为80%的乙醇溶液溶解，定容至25mL，配制得到质量浓度为0.80mg/mL的芦丁标准溶液。

准确吸取新配制的芦丁标准溶液0、125、250、500、625、750、1500μL于10mL的比色管中，加入体积分数80%的乙醇溶液至9mL，加入5%的Na-NO2溶液300μL，摇匀，放置6min。

加入10%的Al（NO3）3溶液300μL，摇匀，放置6min，再加入1mol/L的NaOH溶液500μL，摇匀，静置10～15min。

以80%的乙醇溶液为试剂空白作参比液，于510nm波长处测定吸光值。

以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y=ax-b，R2=x，得线性关系。

1.4.2辣木叶总黄酮含量的测定
准确吸取适量辣木叶黄酮提取液，按照芦丁标准曲线制作方法测定吸光度。

由吸光度根据回归方程计算出原提取液中总黄酮的质量浓度（C），测量得到辣木提取液体积（V），然后计算出辣木叶中总黄酮的提取率。

辣木叶中总黄酮提取率（以芦丁计）%=C×VM×100其中：C为样液经吸光度算出的原提取液中总黄酮的质量浓度（g/mL）；V为提取液的总体积（mL）；M为称取的辣木叶粉质量（mg）。

方法一：乙醇超声提取
1.5单因素试验
1.5.1料液比对辣木叶总黄酮提取率的影响
准确称取1.0g辣木叶粉5份，分别置于100mL的烧杯中，加入体积分数80%的乙醇溶液混匀，选择提取温度20℃、提取时间20min、超声波处理功率150W，分别考察料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40（g/mL）对辣木叶总黄酮提取率的影响。

提取液于4200r/min下离心20min，取上清液测定吸光度值，计算总黄酮提取率。

1.5.2提取时间对辣木叶总黄酮提取率的影响
准确称取1.0g辣木叶粉5份，分别置于100mL的烧杯中，加入体积分数80%的乙醇配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，选择超声功率150W、提取温度20℃，分别考察超声处理时间为10、20、30、40和50min对辣木叶总黄酮提取率的影响。

提取液于4200r/min下离心20min，取上清液测定吸光度值，计算总黄酮提取率。

1.5.3超声功率对辣木叶总黄酮提取率的影响
准确称取1.0g辣木叶粉5份，分别置于100mL的烧杯中，加入体积分数80%的乙醇配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，选择提取时间40min、提取温度20℃，分别考察超声功率为120、150、180、210和240W时对辣木叶总黄酮提取率的影响。

提取液于4200r/min下离心20min，取上清液测定吸光度值，计算总黄酮提取率。

1.5.4提取温度对辣木叶总黄酮提取率的影响
准确称取1.0g辣木粉5份，分别置于100mL的烧杯中，加入体积分数80%的乙醇配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，选择提取时间40min、提取功率210W，分别考察处理温度为20、30、40、50和60℃时对辣木叶总黄酮提取率的影响。

提取液于4200r/min下离心20min，取上清液测定吸光度值，计算总黄酮提取率。

1.6辣木叶总黄酮提取响应面优化试验方案设计
试验采用Design-Expert8.0.6.1软件中的Box-Behnkendesign设计原理，以提取温度、时间、料液比和功率4个因素为自变量，以总黄酮提取率为响应值设计试验，并在最优提取条件下对优化结果进行验证试验。

Box-Behnken试验因素及水平编码值见表1，试验设计编排组合见表2，共29个实验点，其中24个析因点，5个中心点。

方法二：水浸提
1 材料与方法
1.1材料辣木叶，老师提供；DZKW-4型电热恒温水浴锅；万用电炉；722型
可见分光光度计；其他为实验室常用仪器设备
1.2方法
1.2.1 辣木叶中总黄酮提取工艺。

取约170g辣木叶粉，按料液比1：5g/L
加水，加热至沸腾并维持75min，使辣木叶中的总黄酮尽可能浸出。

煎煮结束后，先用6层纱布粗滤，滤去较大的残渣。

所得滤液再用高速离心机5000r/min离心10min，分离除去细微残渣，最后得澄清提取液。

测定所得总黄酮含量。

1.2.2 总黄酮含量测定
与方法一中1.4相同
1.3正交实验
1.3.1 为确定总黄酮的最佳提取工艺，以料液比、煎煮温度和煎煮时间为主
表1
方法三：丙酮水溶液提取总黄酮
1 材料与方法
1.1材料辣木叶，老师提供；可见分光光度计；旋转蒸发器；紫外分析仪；
循环水多用真空泵
1.2方法此方法除了提取剂换成了丙酮水溶液外，其余步骤均与乙醇提取
一样。

1.3正交实验。

为确定总黄酮的最佳提取工艺，以料液比、温度、提取时间
1.4总黄酮含量测定
测定方法与方法一1.4相同1
1.5此法与乙醇提取工艺比较
此法虽然提取效率略低，但提取物纯度更高，具有提取液颜色浅，杂质少，易于纯化，过滤性能好，浓缩能消耗大，溶剂易回收等优点。

1.7数据处理与分析
使用Excel2007、OriginPro8.0和DesignEx-pert8.0软件对试验数据进行统计分析和建立回归方程模型。

所有试验均重复3次取平均值
备注：由于采用通江产的辣木叶，其具体黄酮含量未知，先采用以上方法进行实验，实验进程中根据具体情况调整实验操作。