时间分辨免疫荧光技术-李超

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什么是时间分辨免疫荧光技术？
例如：
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，它们的荧光
光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长的特点；
采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其
一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2 连接；
在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在
增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放
出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千
万倍地放大。
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通过时间延迟，将特异性荧光 与非特异性荧光分辨开来
电化学发光免疫分析(Leland, 1990)
生物芯片(美国Luminex公司, 1997)
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什么是免疫荧光技术？
基本原理：
免疫荧光技术是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记
技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其 免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检
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高稳定性，高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长
时间分辨免疫荧光分析相较于化学发光的优势
时间分辨荧光
化学发光
• • • • • • • • •
发光效率 重复检测 本底噪声 灵敏级数 标记物 标记位点 标准曲线 多标记 科研开发
95% 可无数次 零本底 10-18 原子 可达20个/抗体 稳定达一年以上 最多可达四标记 有
PSA Free/total 前列腺特异抗原/总量
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时间分辨免疫荧光技术的应用
产前筛查
意义：
预防患有严重遗传性疾病和先天畸形 的胎儿出生
遗传疾病检查
新生儿筛查 贫血检查
及早发现某些危害严重的先天性遗传
代谢性疾病 为乙型肝炎临床早期诊断和治疗提供
血液疾病检查
时间分辨免疫荧光技术
演讲人：李超 2015年2月3日
主要内容
目前有哪些标记免疫学分析方法？
什么是免疫荧光技术？
什么是时间分辨免疫荧光技术？ 时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？ 时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？
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目前有哪些标记免疫学分析方法？
白血病分型 免疫细胞分型 细胞毒试验 表面抗原 表面抗体
病原学依据
传染病检查
乙肝系列
e抗原 e抗体 核心抗体
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结束语
时间分辨免疫荧光技术作为一项 具有广阔发展潜力的新兴生物学技 术，将会给标记免疫学带来一场革 命。
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测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复 合物及其存在的部位。
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
概念： 时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构
的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经
免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故 分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。
免疫荧光分析(Coons, 1941)
放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶联免疫分析 (Engvall, 1971)
胶体金标记免疫分析(Faulk和Taylor, 1971)
化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)
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时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？
精确度上的优势:
放射免疫
酶联免疫 化学发光
（精度：10-12mol/L）
（精度：10-9 mol/L）
胶体金标记 （精度：10-15mol/L） （精度：10-15mol/L） 电化学发光 （精度：10-17mol/L） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）
内分泌检测
糖尿病指标检测
胰岛素、C－肽甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，以上各项目的联合检测，
为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据 用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和用于
胰岛素瘤的诊断
• 做科研
• 试剂种类 • 试剂价格
低
高
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时间分辨免疫荧光技术优点总结
零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长
标准曲线稳定性好
易于自动化 对环境及人体没有任何影响
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时间分辨免疫荧光技术的应用
甲状腺功能检测
T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、 Ab 、TPO Ab
E2 Testo
催乳素
雌二醇 睾酮
Prog
SHBG
孕酮
性激素结合球蛋白
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时间分辨免疫荧光技术的应用
肿瘤科检查：
AFP PSA B2-M NSE PAP CEA 甲胎蛋白 前列腺特异抗原 Beta 2微球蛋白 神经元烯醇化酶 前列腺酸性磷酸酶 癌胚抗原
意义：
肿瘤标志物是指示体内肿瘤存在 并反映其一定的生物特性的生化物 质。通过测定其存在或含量，对于 肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导 治疗，监测复发或转移及判断预后 等。
对诊断肢端肥大症是一项特异的方法
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时间分辨免疫荧光技术的应用
妇产科检查：
hCG
LH-Spec FSH
意义：
检测这些激素的含量对于生殖生
绒毛膜促性腺激素
黄体生成素(特异性) 促卵泡激素
理的研究、疾病的诊断、治疗、随
访及计划生育工作的开展具有重要 的意义。
PRL
1% 不可重复 干扰大 10-15 大分子化合物 1个/抗体 稳定 2 到 4周 无 无
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时间分辨荧光和电化学发光比较的优势
时间分辨荧光
电化学发光
• 标记物 • 多标记技术
Eu, Sm, Te, Dy 有 能 58种临床,24种科研
钌 无 无 28种临床, 无科研试剂
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技术上的先进性
时间、光谱分辨
特异性荧光与非特异 性荧光分离度高 发射荧光与激发荧 光分离度高
零背景、高特异性
荧光性大大提高
解离、增强 稳定的荧光螯合物
线性范围更宽 重复性更好
特点
标记位点 标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小 单、双标记 标记方法 多标记 同一试剂盒可同时测多个项目
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
基本原理：
用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、 酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特 异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分 析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度； 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓 度，达到定量分析的目的