第四章-免疫分析技术剖析教学内容

（1）荧光免疫分析技术
❖ 直接法
❖ 优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少， ❖ 缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光
抗体
（1）荧光免疫分析技术
❖间接法
❖ 优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一 种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
❖ 应用：常用于微生物检测，例如：沙门氏菌。
免疫分析技术的特点
❖ 高度的灵敏性：可检测10-18~10-6级别的物质；（免 疫聚合酶链反应，免疫沉淀反应）
❖ 高度的特异性：可区别物质间细微的差异，这是其 他技术无法比拟的。
与目前农药残留的主要检测方法气相色谱分析法 和高效液相色谱法等相比，免疫分析方法具有明显优 势。
① 样品前处理复杂 ② 操作繁琐 ③ 需要昂贵的仪器设备 ④ 检测时间长
❖ 基本原理：荧光免疫分析法是将不影响抗原抗体活性 的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗 原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异 性荧光反应。
（1）荧光免疫分析技术
❖ 荧光现象与荧光物质 ➢ 荧光素(fluorescein): 在蓝光或紫外线照射下，发出 绿色荧光的一种黄色染料。用于荧光抗体技术中的 荧光染料。 ➢ 常用的荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC），四乙基 罗丹明（RB200），四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC），酶作用后产生荧光的物质。
（1）荧光免疫分析技术
❖ 抗体的荧光素标记 ➢ 用于标记的抗体要求：高特异性和高亲和力；不应含有 针对标本中正常组织的抗体；一般需经纯化提取后再作 标记。 ➢ 作为标记的荧光素要求：具有能与Ab分子形成共价健的 化学基团；与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率； 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；与Ab结合后不影 响Ab的生化与免疫性质；标记方法简单、安全无毒；与 蛋白质的结合物稳定，不易解离，易于保存。
免疫分析技术的分类
❖ 根据抗原和抗体在反应中存在方式不同分为： ➢ 均相分析（液相免疫分析）：不需要将游离抗 原与结合物分离，直接进行测定。特点：简单 省时，适合于测定小分子化合物，灵敏度10-9 g/ml； ➢ 异相分析（固相免疫分析）：抗原抗体反应后， 将结合物与游离抗原（或抗体）及样品用常规 物理方法分离，然后对分离出的结合物进行检 测。特点：有较高灵敏度灵敏度10-12 g/ml，干 扰少。
• 可大大简化甚至省去复 杂的样品前处理过程
• 操作简便 • 无需昂贵的仪器设备 • 快速、灵敏、特异，可
短时间检测大量样品
GC/HPLC法
IA分析法
wk.baidu.com疫分析技术的分类
❖ 根据免疫反应的动力学类型分为： ➢ 竞争反应：标记抗原（Ag*）和非标记抗原 （Ag）共同竞争与抗体的反应。 Ag（样品） + Ab AgAb Ag *（定量加入） + Ab *AgAb ➢ 夹心反应：将抗体、抗原和第二抗体结合在一 起，形成夹心式结合物。最终，检测夹心结合 物上标记物，计算样品中抗原含量。 Ab1 + Ag + Ab2* Ab1-Ag-Ab1*
第二节 四种常见免疫分析技 术
（1）荧光免疫分析技术
❖ 荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种， 是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性 和直观性结合起来的一种方法。 ➢ 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得 成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位 的技术称为荧光抗体技术。
❖ 由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准 化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高 特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记 免疫技术。
免疫分析技术的分类
❖ 根据标记方法的不同分为： ➢ 荧光免疫分析技术 ➢ 放射免疫分析技术 ➢ 酶联免疫分析技术 ➢ 发光免疫分析技术
❖ 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、 胶体金及化学、生物发光剂等作为追踪物，标记抗体或 抗原进行的抗原抗体反应，并借助荧光显微镜、射线测 量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精 密仪器，对实验结果直接进行观察或进行自动化测定。
γ计数器 β液闪仪
（3）酶联免疫分析技术
❖ 继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展 起来的一大新型的标记免疫技术，这一技术的 诞生被誉为免疫血清学技术的一场革命，是应 用最广泛的免疫学技术之一。
❖ 1971年，Engvall和Perlman首次报道建立酶联 免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）。
（2）放射免疫分析技术
2. 常用标记核素：
✓ 125I： γ 射线，半衰期 60 天 ✓ 3H： β 射线，半衰期 12.3 年
3. 测量仪器
✓ γ 计数仪 ✓ β 液闪仪
4. 优点：
✓ 检测灵敏度高，高达ng~pg水平; ✓ 测定的准确性好，数量级的回收率接近100%.
5. 缺点：
✓ 操作相对复杂， ✓ 同位素半衰期短，保存及操作相对复杂。
第四章-免疫分析技术剖析
第一节 免疫检测技术概述
❖ 免疫检测技术起源：检测病原微生物抗原及抗体的血清 学诊断。 ➢ 1896年G. Widal和A. Sicard利用伤寒病人的血清与 伤寒杆菌发生特异性凝集的现象，有效准确地诊断 伤寒。
❖ 免疫分析法（immunoassay, IA）是利用抗原抗体反应 产生免疫复合物的原理分析微量或超微量待测物质的一 种分析手段，往往需要借助一种信号放大系统把抗原抗 体结合的反应信息予以展现和放大。 ➢ 免疫分析技术是以抗原与抗体在体外特异性、可逆 性结合反应为基础的分析技术。 ➢ 免疫分析法是将免疫反应与现代测试手段相结合而 建立的超微量测定技术。
在医学检验中的应用:荧光抗体技术在临床检验上已 广泛用于细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病 的诊断等
荧光显微镜
（2）放射免疫分析技术
1. 放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） ❖ 定义：是以放射性核素为标记物的标记免疫分析
方法，用于定量测定受检标本中抗原。 ❖ 1959年，Yalow和Berson创建的分析方法。 ❖ 基本原理：