选择性剪接与大肠癌关系的研究进展赵一军杨俊作者单位200233

选择性剪接与大肠癌关系的研究进展
赵一军杨俊
作者单位：200233 上海，上海交通大学附属上海市第六人民医院普外科
大肠癌（CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,中国大城市的大肠癌发生率已居恶性肿瘤的第2～3位。

由于早期缺乏临床症状或症状不典型，大肠癌不易被早期发现，故患者预后较差。

如果患者处于良性肿瘤或早期大肠癌阶段，及时实施手术将获得很好的疗效；反之，如果患者处于中晚期大肠癌阶段甚至发生器官转移，即使手术切除肿瘤后再施以辅助放射和化学治疗手段，仍难以获得较好的疗效。

因此，如何提高大肠癌的早期诊断率，寻找敏感的生物学指标，发现新的药物作用靶点，提高患者生存率、降低死亡率，已成为近年来大肠癌研究的新热点。

基因选择性剪接的相关研究为大肠癌的诊断和治疗提供了新思路。

1 选择性剪接概述
1977年，Chow等[1]首次对Pre-mRNA剪接进行报道。

Pre-mRNA通过去除内含子、连接外显子形成成熟mRNA，包括组成性剪接（CS）和选择性剪接（AS）[2]。

选择性剪接是指从一个Pre-mRNA中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接变异体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致表型不同。

研究[3]结果过表明，95%的人类基因编码选择性剪接变异体亚型。

选择性剪接是一种重要的转录后调控机制，可增加蛋白质的多样性和mRNA的稳定性，对细胞的分化、发育、生理功能和病理状态都有重要意义。

Tazi等[4]的研究发现，选择性剪接与人类许多疾病，尤其是肿瘤的发生密切相关。

目前，结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、乳腺癌、肺癌等癌症选择性剪接变异体已见报道[5-8]。

2 选择性剪接的机制和调控
Pre-mRNA的选择性剪接发生在细胞核中，由剪接体执行，剪接体包括5个核小核糖核蛋白复合体（snRNPs）U1、U2、U4、U5和U6，以及100种以上非snRNPs的相关蛋白。

剪接复合体的形成开始于U1snRNP 通过snRNA与mRNA间的特定碱基配对结合到5’剪接位点，同时，异质二聚体U2AF结合到多嘧啶区和3’剪接位点；U2snRNP通过碱基配对结合到分支点；由U4、U5和U6snRNA组成的三聚小核蛋白加入剪接体；U6snRNP通过结合到5’剪接位点取代U1，U1和U4则从剪接体中释放；mRNA的3’剪接位点被剪接掉，经过两个连续的转酯反应完成内含子的切除和外显子的连接[9-12]。

目前已发现多种Pre-mRNA选择性剪接形式。

较常见的有以下几种[2]：①外显子遗漏，内部外显子可被选择性保留或切除。

②内含子保留，内含子可被选择保留在成熟mRNA中。

③外显子排斥，多个外显子可进行不同组合的选择性剪接。

④在不同的5’或3’剪接位点进行选择性剪接。

⑤对5’末端和3’末端进
行选择性剪接。

复杂的选择性剪接方式均是以上剪接形式的叠加或组合。

选择性剪接过程多种顺式作用元件和反式作用因子的相互作用调节。

顺式作用元件为RNA中调控剪接的区域，包括外显子剪接增强子（ESEs）、内含子剪接增强子（ISEs）、外显子剪接沉默子（ESSs）和内含子剪接沉默子（ISSs）。

外显子剪接增强子和内含子剪接增强子可促进剪接复合体的组装和对剪接位点进行识别；外显子剪接沉默子和内含子剪接沉默子则具有相反的作用。

反式作用因子是指结合在RNA特定区域上对剪接过程起调控作用的RNA结合蛋白质。

其中，SR蛋白家族和hnRNP蛋白家族是当前研究较为深入的反式作用因子。

SR蛋白是多细胞生物中高度保守的反式作用因子家族，富含精氨酸和丝氨酸，其成员包括SRp20、9G8、SF2／ASF（SRp30a）、SC35（SRp30b）、SRp30c、sRp40、SRp46、P54、SRp55、SRp75等，基本结构特征为N-末端含有的1个或两个RNA识别模序（RRM）,C-末端富含精氨酸/丝氨酸二肽结构域，通常结合到ESEs导致剪接发生。

hnRNP蛋白家族（hnRNPA1（多聚嘧啶序列结合蛋白）等）均含有RNA识别模序（RRM）或核不均一核糖核蛋白K同源结构域（KH结构域），可结合到ESEs和ISSs上，并且在许多情况下阻止剪接复合体的组装。

顺式作用元件（增强子、沉默子）通常会重叠形成一个混合调控元件，反式作用因子（SR蛋白家族、hnRNP蛋白家族等）结合到这些调控元件所起的相反作用可决定剪接。

SR蛋白家族通常被认为对选择性剪接具有正性调控作用，但并非全部如此，有些SR蛋白具有负性调控作用[13]。

同样，并非所有的hnRNP蛋白家族成员均具有负性调控作用[14]。

选择性剪接及其调控对于维持生物的正常功能具有重要意义，选择性剪接的异常是导致疾病发生的重要原因之一。

3 相关基因选择性剪接
选择性剪接是一种重要的转录后调控机制，与大肠癌的发生、发展、浸润和转移密切相关，以下就相关基因选择性剪接对大肠癌的诊断、预后和靶向治疗作一总结。

3.1 CD44 CD44基因含有组成性外显子和选择性剪接外显子各10个，选择性剪接外显子位于第5、6组成型外显子之间[15]。

组成性外显子存在于所有转录产物之中，编码的蛋白有4个功能区，即信号肽区、N-末端细胞外区、跨膜区和C-末端细胞内区，仅含组成外显子的CD44转录子称为标准型CD44（CD44s），含有选择性剪接外显子的CD44转录子称为变异型CD44（CD44v）。

CD44基因的编码产物称为CD44蛋白，是一类分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，参与细胞黏附与迁移、伤口愈合、淋巴细胞归巢、肿瘤细胞转移，以及细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用[16-18]。

研究发现[18-19]至少有26种CD44v，其中对CD44v3和 CD44v6在大肠癌方面的研究最为广泛和深入，有望成为新的肿瘤标志物和药物作用靶点。

CD44v3具有硫酸肝素、透明质酸、硫酸软骨素等结合区域，能结合多种肝素结合生长因子，如肝素结合表皮生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、β成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子等[19-20]。

CD44v6 作为依赖HGF的c-met（HGF/SF-c-Met）信号通路受体，调控上皮细胞-间充质转化，参与激活Kirsten大鼠肉瘤病毒同源癌基因（K-ras基因）的正反馈环路和肿瘤的转移[20-22]。

Coppola等[23]采用免疫组织化学等方法分析大肠癌组织标本，结果显示，腺瘤组织和肿瘤
组织中CD44v6的表达均显著高于正常黏膜组织和肿瘤转移组织。

Yamane等[24]采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）和免疫组织化学法检测后发现，血清CD44v6和组织CD44v6与淋巴结转移具有相关性，推测CD44v6可作为大肠癌独立的预后指标。

Vizoso等[25]研究结果显示，肿瘤组织CD44v6的表达水平显著高于癌旁组织，CD44v6高表达的患者无肿瘤复发的生存期明显缩短。

Chun等[26]选取44例大肠癌标本，采用聚合酶链反应（PCR）检测正常大肠黏膜和大肠癌组织中CD44v和CD44v6的表达水平，结果显示，正常大肠黏膜中CD44v和CD44v6的表达水平与大肠癌组织间的差异均有统计学意义。

Banky等[27]采用PCR和基因测序对人类结肠癌细胞株（HT25、HT29、HCT116）中CD44选择性剪接变异体进行检测，结果显示，CD44v3和CD44v6在转移性大肠癌中大量表达，与β-肌动蛋白比较，差异具有统计学意义。

然而，Zalewski等[28]采用ELISA法对114例大肠腺癌患者的血清标本进行分析，结果显示，血清中CD44v6与患者临床病理特征无相关性，故CD44v6不能作为大肠癌的预后因子。

综上所述，由于实验设计、实验耗材和结果处理的不同，对于其结论尚存在一定争议。

相关研究结果显示[15,20]，CD44v、CD44v3和CD44v6可作为新的肿瘤标志物、判断预后的指标和可能的药物作用靶点，为大肠癌的药物靶向治疗提供新思路。

3.2 APC（结肠腺瘤性息肉病基因）APC基因由15个外显子组成，其失活是大肠肿瘤发生的早期分子事件，但稳定于肿瘤发生、发展的全过程,参与Wnt信号转导途径、细胞生长分化、微管细胞骨架形成、染色体稳定性和细胞凋亡[29-31]。

外显子1、3、4、8、9、10、11、14、15的选择性剪接已有报道[32-33]，主要由剪接位点和顺式作用元件的突变和表达水平、结合域或反式作用因子数目的改变所致。

APC基因编码产物为APC蛋白，位于细胞质，其前17个氨基酸通过形成α-螺旋棒介导同源二聚体形成；C-末端包含可降解β-catenin的部位和结合细胞骨架微管的部位。

APC的C-端通过与至少3种不同蛋白（EB1、HDLG和PTP-BL）的结合，调控细胞周期进程和细胞生长。

APC基因突变造成外显子遗漏[34-35]，导致其编码的APC蛋白发生改变，产生截短的无活性的APC蛋白，APC截短蛋白可结合于野生型APC蛋白，并对野生型蛋白具有负显性效应，使其失活而导致肿瘤发生[36]。

Goncalves等[37]研究发现，富含丝氨酸/精氨酸剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1，SPSF1, ASF/SF2)和富含丝氨酸/精氨酸剪接因子6(serine/arginine-rich splicing factor 6，SPSF6, SRp55)（正性调控作用）的丢失或减少，以及hnRNPA1的增多（负性调控作用）均可导致ASF/SF2外显子剪接增强子失活；因此，外显子14内部的错义突变可导致外显子14遗漏，以及外显子13与15之间发生框移突变，造成下游终止密码子提前出现，进而产生截断的APC蛋白。

APC基因作为抑癌基因，其突变与大肠癌的发生密切相关。

随着选择性剪接在大肠癌中的研究不断深入，对APC基因选择性剪接变异体的结构和功能的认识，将在大肠的早期诊断、治疗和预后具有重要指导意义。

3.3DCC（结直肠癌缺失基因）DCC基因由29个外显子构成，外显子1～7编码4个免疫球蛋白结构域，外显子8～21编码6个Ⅲ型纤维连接蛋白结构域，外显子22～29编码胞内区域[38]。

DCC基因的表达产物DCC蛋白属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要包括3个功能区，即胞外区、跨膜区和胞内区。

DCC蛋白参与细胞之
间，细胞与基质之间的相互作用，维持细胞正常的分化和生长。

DCC基因外显子17、26的选择性剪接已见报道[38]，外显子17选择性剪接导致纤维连接蛋白4与5之间发生改变，造成与细胞黏附因子（N-CAM）相似的区域产生变化，进而引起DCC基因编码的DCC蛋白失活；外显子26编码胞内区域，其选择性剪接2个密码子丢失和第3个密码子氨基酸置换，导致酪蛋白激酶Ⅱ丝氨酸磷酸化潜在结合位点丢失。

Mazelin等[39]利用APC/DCC基因敲除小鼠模型，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学、免疫沉淀和蛋白质印迹等技术检测后发现，在小鼠模型上netrin-1过度表达，抑制DCC基因的促细胞凋亡作用，提示DCC基因的缺失可能与促进肿瘤生长有关。

Jen等[40]和Kato 等[41]分别对大肠癌肺转移和肝转移进行研究，认为DCC基因的缺失与大肠癌肝、肺转移相关。

Huerta等[38]对SW480和SW620结肠癌细胞株进行研究，发现DCC基因的缺失可作为判断结肠癌患者不良预后的生物学指标。

因此，检测DCC基因的选择性剪接变异体可为大肠癌患者的诊断、治疗和预后判断提供依据。

3.4VEGFA（血管内皮生长因子A）VEGFA基因由8个外显子和7个内含子构成，是研究最为深入的血管内皮生长因子之一，具有增强内皮细胞的生存能力，促进有丝分裂，诱导毛细血管芽新生、增加微血管通透性、促进细胞移行和抑制细胞凋亡等多种功能[42]。

VEGFA基因外显子6、7、8的选择性剪接已有相关的研究[8]，至少产生25种选择性剪接变异体[43]。

VEGFA Pre-mRNA外显子8的C-末端的剪接方式不同可产生两大亚家族剪接体，即VEGFAxxx和VEGFAxxxb（xxx 表示氨基酸的数目）。

VEGFAxxx是通过临近剪接位点（8a）的方式产生，具有促血管生成作用；而VEGFAxxxb 是通过远端剪接位点（8b）的方式产生，具有抗血管生成作用。

Kumar等[44]检测实验组（大肠癌108例）和对照组（正常人136例）患者血清中VEGFA的含量，结果显示，不同的浸润深度、肿瘤TNM分期和Dukes 分期间VEGFA165含量的差异具有统计学意义，表明血清中VEGFA165为大肠癌早期诊断的指标，为判断大肠癌的浸润深度、淋巴结转移和肝转移预后提供依据。

Diaz等[45]对112例大肠癌癌组织和正常组织标本进行研究，结果显示，VEGFA165b的表达下调与大肠癌的分期、血管浸润和淋巴结转移密切相关，提示VEGFA165b具有抑制肿瘤的作用，可作为判断大肠癌扩散和转移的敏感指标。

Tayama等[46]对165例大肠癌的研究亦得到相似的结论。

Rennel等[47]采用PCR、免疫组织化学等技术检测14例大肠癌组织中的VEGFA121b 表达，发现肿瘤组织中VEGFA121b表达下调；进一步对LS174t结肠癌细胞株的研究结果提示，VEGFA121b 具有抑制肿瘤生长的作用，可作为判断结肠癌患者预后的指标。

VEGFA选择性剪接及其调控通路已成为治疗大肠癌的重要靶点，针对VEGFA的治疗靶点主要有：①以贝伐单抗为代表的人源多克隆抗体，通过阻止共同激酶区域受体结合位点，抑制VEGFAxxx和VEGFAxxxb 所有剪接变异体与受体的结合，其缺点为不具有特定的靶点，非特异性地抑制所有促血管生成和抗血管生成的变异体，限制贝伐单抗在大肠癌治疗的应用[48]。

②哌加他尼钠特异性地抑制促血管生成变异体VEGFAxxx，而不结合抗血管生成变异体VEGFAxxxb，增强其拮抗肿瘤血管生成的作用[49]。

③索拉非尼和舒尼替尼通过抑制受体酪氨酸激酶活性来阻断下游信号的传递，抑制VEGF受体的活性[48, 50]。

④ASF/SF2、
SRp40、SRp55参与VEGFA选择性剪接的调控，ASF/SF2、SRp40磷酸化可促进VEGFAxxx的产生，而SRp55磷酸化则可促进VEGFAxxxb的产生，SRPIN340可调节VEGFAxxx与VEGFAxxxb的转录比例[50]。

VEGFA的靶向治疗已成为肿瘤治疗的热点话题，但也存在诸多问题从而限制高特异性靶向药物的开发，比如对已形成的肿瘤血管往往无效；药物有效性偏低；仅阻断一条或几条通路，会引起其他通路的代偿性增强，影响抗肿瘤血管生成的治疗效果等。

随着研究的深入，以上问题将会逐个加以解决，并将肿瘤的靶向治疗推向一个新的阶段。

3.5Cyclin D1（细胞周期蛋白 D1）Cyclin D1蛋白是细胞周期蛋白家族的重要成员，为细胞周期正性调节因子，与CDK4／CDK6结合形成Cyclin D1-CDK4／CDK6复合体，激活CDK4／CDK6蛋白激酶活性，磷酸化视网膜母细胞瘤基因蛋白，磷酸化失活的视网膜母细胞瘤基因蛋白释放出与其结合的转录因子E2F，促进DNA的合成，加快细胞由G1期进入S期，使细胞生长失控从而导致肿瘤发生[51]。

因此，Cyclin D1基因被认为是一种癌基因，其过度表达与大肠癌、胃癌、食管癌等多种癌症的发生相关，关于其转录机制和功能的研究近年来已见报道[52]。

Cyclin D1基因（CCND1、bcl-1或PRAD1），含有5个外显子和4个内含子，其第870号核苷酸（4号外显子第242号密码子）处存在有A/G多态性，使其转录产物mRNA发生不同位点的选择性剪接，产生Cyclin D1a（包含外显子1～5）和Cyclin Dlb（包含外显子1～4和部分内含子4）[53]，顺式作用元件ASF/SF2和Sam68调节此过程倾向于Cyclin Dlb[2, 54-55]。

Cyclin Dl基因G→A转换时，产生的变异体Cyclin Dlb 缺失富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸序列的蛋白质（PEST蛋白）降解相关区域，增加Cyclin D1蛋白在细胞内的稳定性，具有更长的半衰期，从而使肿瘤发生率升高。

Li等[56]采用免疫荧光、免疫沉淀和蛋白印迹等方法证实Cyclin Dla可增强DNA损伤应答，与染色体的稳定性密切相关。

Lewis等[57]对161例直肠癌患者和213例健康者进行研究，结果表明，Cyclin Dlb可增加直肠癌的发病风险。

Forones等[58]对123例巴西大肠癌患者和120例健康者进行研究，结果表明，Cyclin Dlb可增加大肠癌的发病风险。

因此，Cyclin Dlb可作为大肠癌早期诊断的重要生物学指标和治疗大肠癌的治疗靶点，下调Cyclin Dlb可维持正常的细胞周期。

4 其他剪接变异体
近年来，选择性剪接在大肠癌中的研究已成为热点话题；此外，一些基因编码的选择性剪接变异体与大肠癌的预防、诊断、治疗和预后密切相关。

Misquitta等[8]利用基因芯片和RT-PCR技术对5 183个选择性剪接外显子进行分析，大部分病例的VEGFA、微管微丝交联因子1（MACF1）、β淀粉样蛋白前体蛋白（APP）和细胞命运决定因子（NUMB）基因发生选择性剪接，其中APP和NUMB基因相对特异性发生于原发性大肠癌和乳腺癌。

Thorsen等[59]利用基因芯片对108例大肠癌标本进行分析，结果显示，转录因子12（TCF12）、氧化固醇结合蛋白样蛋白1A（OSBPL1A）、驱动蛋白结合蛋白1（TRAK1）、锚定蛋白3（ANK3）、细胞周期检验点激酶1（CHEK1）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UGP2）、LIM结构域7（LMO7）、酰基辅
酶A合成酶长链家族成员5（ACSL5）和肌切蛋白（SCIN）基因选择性剪接相对特异性地发生在大肠癌中。

Yi等[60]认为，APC、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）、VEGFA、难语症易感性候选基因1（DYX1C1）和细胞Fas相关死亡结构域类白细胞介素1-β转化酶抑制蛋白（c-FLIP）等基因选择性剪接变异体在大肠癌中的表达，并可作为大肠癌预防、诊断和判断预后的潜在生物学指标。

Miura等[2]认为，VEGFA、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A）、孕烷X受体（PXR）、细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、生存蛋白（BIRC5、survivin）、Kirsten大鼠肉瘤病毒同源癌基因（K-RAS）、H2A组蛋白家族成员Y（macroH2A1）、Y性别决定区盒基因9（SOX9）、溶质运载蛋白家族39成员14（SLC39A14）等基因选择性剪接在大肠癌中表达，这些基因的剪接变异体为大肠癌的治疗提供新的药物作用靶点。

5 展望
选择性剪接是转录后水平调控基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，在大肠癌的发生、发展、浸润和转移中扮演着重要的角色，为大肠癌的预防、诊断和判断预后提供潜在的生物学指标，并为大肠癌的治疗提供新的药物作用靶点。

但是，基因的选择性剪接的分子机制及其调控机制目前尚不明确，需要进一步的实验研究发现和证实。

随着对选择性剪接在大肠癌中的研究不断深入，选择性剪接在大肠癌中发生、发展的机制将逐步揭开，新的选择性剪接的亚型将被发现，为大肠癌的预防、诊断、预后判断和治疗提供崭新的途径和科学依据。

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（收稿日期：2013-09-09）
（本文编辑：陈蔚）。