黄酒酿造过程中真菌群落组成及挥发性风味分析_牟穰_毛健_孟祥勇_刘芸雅

牟穰，等：黄酒酿造过程中真菌群落组成及挥发性风味分析

黄酒酿造过程中真菌群落组成及挥发性风味分析

牟穰1，2，毛健*1，2，3，孟祥勇1，2，3，刘芸雅1，2（1.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴312000）

摘要：利用宏基因组学技术对不同发酵时期黄酒醪液中的真菌进行鉴定，并利用GC-MS分析黄酒中的主要高级醇、醛类和酯类等挥发性风味物质。结果表明：黄酒前酵阶段真菌有着较高的群落多样性，在发酵排料当天鉴定出22种真核属类；其中曲霉属（Aspergillus）在整个发酵过程相对丰度均达到90%以上，远远高于其它真菌，是黄酒发酵过程中的特征微生物；随着黄酒发酵的进行，优势真菌呈现先降低后增加趋势。挥发性风味物质的测定结果表明，在发酵过程中挥发性物质的生成受发酵液性质影响较大，大部分在第4天有着较高的含量，随着发酵的进行，发酵液的较高酸度和酒精度以及低pH降低了微生物的多样性，使得挥发性风味物质含量有所降低。

关键词：麦曲；发酵醪液；真菌；多样性；挥发性风味物质

中图分类号：TS262.4文献标志码：A文章编号：1673—1689（2016）03—0303—07 Analysis of Fungi Diversity and Volatile Flavor Compounds

in Chinese Rice Wine Fermentation Process

MOU Rang1，2，MAO Jian*1，2，3，MENG Xiangyong1，2，3，LIU Yunya1，2（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China； 2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China； 3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine，Shaoxing312000，China）

Abstract：As the Chinese national specialty，Chinese rice wine has a long history and unique production and fermentation technology，the microbial community and metabolites contribute to the unique flavor during the rice wine brewing.In this study，the metagenome technology was applied to explore the fungi diversity and the GC-MS was used to analyze the volatile flavor compounds in ferment mash of different fermentation periods.The results showed that the ferment mash had higher fungi diversity at the initial stage，22genera were identified in0day.The relative abundance of Aspergillus were all above90%，which was much higher as compared with other eukaryotic microorganisms during the fermentation process.The advantageous fungi changed obviously，the genera number decreased at first four days and increased later.The analyzed of volatile flavor compounds showed that the generation of volatile substances were greatly influenced by physical and chemical properties of fermented mash.High acidity，alcohol and low pH reduced the fungi

收稿日期：2014-11-25

基金项目：国家863计划项目（2013AA102203-06）。

*通信作者：毛健（1970—），男，安徽宿州人，工学博士，教授，主要从事食品生物技术研究。E-mail：biaomao@

MOU Rang，et al：Analysis of Fungi Diversity and Volatile

Flavor Compounds in Chinese Rice Wine

Fermentation Process

diversity，and lowered the contents of volatile flavor compounds.

Keywords：wheat koji，ferment mash，fungi，diversity，volatile flavor compounds

黄酒是我国特有的民族特产，在中国已有数千年的历史，它主要以谷物（稻米、小米、黍米、玉米等）为原料，加入麦曲、酵母等进行发酵而成。由于原料、地理环境和酿造工艺的不同，不同区域的黄酒均呈现出独特的风味和口感，按照黄酒风格分为传统型黄酒、清爽型黄酒和特型黄酒[1]。黄酒发酵过程中存在着复杂的微生物群落，包括细菌以及霉菌、酵母菌等真菌。它们不仅能够产各种酶类，降解大分子物质，还能够促进黄酒风味物质的代谢合成，包括有机酸、游离氨基酸、酯类等，赋予了黄酒丰富的营养成分和独特的风味特征[2-3]。

微生物是黄酒酿造过程中必不可少的组成成分，对微生物群落的解析有助于了解黄酒发酵机理。目前对黄酒微生物的分析大多采用传统培养方法，但这种方法存在弊端，如采用分离﹑纯化﹑分子鉴定步骤，需经过一系列繁杂的形态特征和生理生化试验[4-5]。同时利用培养基方法仅能够筛选出少量微生物，大部分微生物因不能培养而遗漏，造成检测的微生物群落结构不准确。

随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究人员使用非纯培养的方法和手段对环境微生物进行全面分析，如16SrRNA克隆建库[6]、条形码测序[7]以及基因芯片[8]等技术已被广泛应用于环境微生物多样性的研究。高通量测序（High throughput sequencing，HTS）是一种全新的测序技术，它能一次进行多个样品测定，还能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，给研究提供了方便[9]。通量高、快速、低成本等优点，使得该方法一经出现就被广泛应用于各种生态系统中，比如土壤[10]、草鱼肠道[11]、海洋沉积物[12]等生态环境中微生物多样性的检测和研究中。近年来，HTS也逐渐应用到传统发酵食品中微生物的多样性研究，如泡菜[13]、干酪[14]、白酒[15]、豆瓣酱[16]等发酵食品，而应用于黄酒中的真菌研究还未见报道。

已发表的有关黄酒微生物的研究主要针对细菌，对于发酵液中的真菌研究较少。然而，真菌在黄酒酿造过程中能产生大量酶类，对黄酒发酵起到十分重要的作用。为探明发酵过程中发酵液风味物质及理化指标的代谢规律，解析黄酒麦曲及发酵醪液中真菌的群落结构，采用宏基因组学对海派清爽型黄酒（上海金枫黄酒）酿造用麦曲和发酵过程中的真菌群落结构进行分析，同时对发酵液风味物质及理化指标进行测定，旨在为解析黄酒酿造过程提供一定的理论依据。

1.1实验样品

黄酒发酵醪液，取自上海金枫酒业股份有限公司，样品发酵天数分别为0、2、4、6、9、12、18d和24d，0d表示投料当天；黄酒生麦曲，取自企业麦曲仓库，为2014年生产。所有样品当天采集完后放入-20℃冰箱保存备用。

1.2样品宏基因组DNA提取

称取不同天数发酵醪液和麦曲样各1g，采用玻璃珠破碎法对样品进行破碎处理，用Soil DNA kit试剂盒（OMEGA，Bio-Tek，USA）对样品进行宏基因组DNA提取，提取方法按说明书进行。

1.3目的区段扩增及高通量测序

扩增选取真菌18S rRNA基因中的ITS1F-ITS2区段作为扩增对象，采用引物ITS1F：CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA和2043R：GCTGCGTTCTTCATC GATGC进行扩增[17-18]。此外，用于PCR扩增的正向引物前加入一段由7个碱基构成的barcode序列，所有样品分别用不同barcode序列进行区分，具体扩增体系及程序如下。

1.3.1PCR反应体系PCR试验采用Trans Gen AP221-02：Trans Start Fastpfu DNA Polymerase （Trans Gen Biotech，China）；共20μL的反应体系：5×FastPfu Buffer4μL，

2.5mmol/L dNTPs2μL，正反向引物各（5μmol/L）0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，模板DNA10ng，剩余的用ddH2O补足至20μL。

1.3.2PCR扩增程序PCR仪采用ABI Gene Amp○R 9700（Applied Biosystems，USA），其反应参数为：1）1×（95℃3min）；2）30×（95℃30s，55℃30s，72℃45s）；3）72℃延伸10min。得到的PCR

产物