毒物毒性实验(8)
经口急性毒性试验方法改良寇氏法
急 性 毒 性 试 验 方 法 ――改良寇氏法 K?rber 法由K?rber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。 改良寇氏法（K?ber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。 一、剂量选择及分组 1、剂量选择 剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。 探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。 2、预试验： 总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。进行正式实验。 用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。 通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。 按下式设计剂量组： 1n a b r -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5， b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。 分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD 50。 3、根据公比(r)计算各组剂量 各组剂量分别为： 第一组：a 第二组：a r
长期毒性试验
长期毒性试验 药物毒性是否产生，取决于： a药物本身的理化特性b给药情况c如何被机体代谢 对一特定药物而言，最重要的影响毒性的因素： a给药途径b体内停留时间c给药频率 （影响靶组织的药物浓度） 1.半数有效量（ED50）：能引起50%的动物或实验标本产生反应的浓度或剂量。 2.半数致死量（LD50 ）：能引起50%的动物死亡的浓度或剂量。 3.治疗指数：TI= LD50/ ED50 药物实验动物的LD50和ED50的比值称为治疗指数（TI），用以表示药物的安全性。 4.安全范围：ED99~LD1（或ED95~LD5）之间的距离。值越大越安全。 ?有效量曲线和致死量曲线的斜率不一样时，以TI评价药物的安全性并不可靠。（原因？）六、药物毒性作用类别 药物不良反应（adverse reaction)：凡是不符合用药目的并为病人带来不适或痛苦的有害反应统称为药物不良反应。 包括：副反应、后遗效应、停药反应、毒性反应、变态反应、特异质反应、致癌性、致畸性、致突变性； （三)药物毒性临床前评价程序（三水平） 第一水平，急性毒性试验： 第二水平，长期毒性试验（第一阶段） 第三水平，长期毒性试验（第二阶段） （四）药物毒理学研究在新药临床试验各阶段的任务 第一期临床研究→探索安全的人用剂量 第二期临床研究→安全性{疗效（有效性）不良反应（安全性） 第三期临床研究→大范围的社会考察 不良反应监测→提高疗效，降低不良反应 多数毒物发挥其毒性作用至少经历四个过程： a毒物吸收后经过多种屏障转运到一个或多个靶部位； b进入靶部位的终毒物与内源靶分子发生交互作用； c毒物引起机体分子、细胞和组织水平功能和结构紊乱； d机体启动不同水平的修复机制。当此机制低下或功能和结构紊乱超过机体修复能力时，机体即出现组织坏死、癌症、纤维化等毒性损害。 长期毒性试验的意义 a判断受试药物能否进行临床试验； b预测人类临床用药时可能毒性和安全范围； c制定临床试验中的防治措施； d确定应该着重评价的生理生化指标； e选择I期临床试验时的初试剂量，等。 一、一般原则 1动物选择： a.敏感动物，年轻动物，雌雄各半 b.2种（啮齿—大鼠6w、非啮齿—比格犬4-6m） c.体重差异不大于平均体重的20% d..单笼饲养、定量喂食
实验二经口急性毒性试验
毒理学实验二经口急性毒性试验 一、实验目的 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LD50的试验设计原则 3、小鼠的经口灌胃技术 二、试剂和材料 1、实验动物： (1)动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g?22g (2)样品来源：首都医科大学实验动物部 2、器材：注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物 秤。 3、试剂：敌敌畏(1400mg/ml)、苦味酸染液(标记用)。 三、实验内容 1、健康实验动物的选择和性别鉴定 选择健康的雄性小鼠(健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。) 肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性 2、实验动物称重、编号和随机分组 选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法(动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物)，每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液 标号1~9,10号小鼠不标记。 3、受试化学物溶液的配制 (1)确定灌胃量：0.1ml/10g (2)确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积 (3)药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。 5、毒性体征的观察和LD50计算 (1)毒性体征的观察： 染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min
(2) LD50的计算： a 实验各组剂量的确定：设 5组，每组雌雄动物各10只 剂量组距d 为： lg LD 100 一 lg LD 0 组数-1 d 为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD0依次加d ,取反对数，即可得出各组剂量 b 、LD50的计算(见附件)： 1 lg LD 50 = X k d' (P i P i 1) Xk:最大剂量的对数 d :相邻两组对数剂量之差 数 Pi :各组死亡率 i :组数 C 、求半数致死量的95%可信区间 标准误公式： S lg LD 50 = d ni :实验动物数。 ?1 lg (lg LD 50 - 1 .96 S lg LD 50 ) 四、实验过程 1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A 组和B 组)，分别在不同实验室。每大 组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组 10只动物。 集体活动：1、2、3、4、5组各1人，进行受试物配制。 P i (1 - P i ) ni - 1 95% 可信区间:
急性经口毒性实验
实验二 急性经口毒性实验 一、实验目的： （一）通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。 （二）通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。 二、测定方法： 本实验以灌胃方式测定敌敌畏DDV 的半数致死量（经口LD50=50～92mg/kg ）。 （一）实验仪器、动物及分组： 1. 健康成年小鼠(18g ～25g)，雌雄各半。动物秤、灌胃针、烧杯、编号笔、解剖剪、小磁盘、鼠笼。 2. 实验前动物要在实验环境中适应3～5 d 时间，以了解其正常活动情况和健康状 况，并淘汰不健康或体重不符合要求的动物 。 3. 本次实验取体重18-25 g 的小鼠，实验时，将小鼠称体重、编号、按随机分组原则，将实验动物分成6组，每组24只，雌雄各半。 （二）剂量选择： 1. 首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似的化学物的LD50，以此值作为受试化学物的预期毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1-2 个剂量组，进行预实验。 2. 各剂量组的间距可根据LD50 计算方法要求按等比级数或等差级数安排。 3. 本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级数排列，常用1：0.8，如敌敌畏的最高剂量为125 mg/kg ，其次剂量组为125 mg/kg *0.8=100 mg/kg ，依次类推为80 、64 和51.2 mg/kg 五个剂量组。 （三）受试化学物配制与稀释 1. 溶剂： 水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶液。 脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、植物油等配制。 2. 受试物的稀释 等容量稀释法，各个剂量组的动物均给予相同单位体重体积的受试化学物，按照事先设计的剂量分别稀释配制为几种不同的浓度的受试物溶液。 例如本次实验五个剂量组: 各剂量组动物给予相同单位体重体积受试物均为10ml/kg 。 等容量稀释法 D ：设计的染毒剂量， mg/kg V ：动物给药量（相同单位体重体积）均为 10ml/kg X ：各组需配制的受试物溶液的浓度（mg/ml ） 如：第一组染毒剂量D=51.2mg/kg ，动物按V= 10ml/kg 体重给药，配制的受试物浓度为X=51.2mg/10ml 依次类推：五个组所需配制的受试物浓度分别为 第一组：51.2mg/10ml 第二组： 64mg/10ml 第三组： 80mg/10ml 第四组： 100mg/10ml 第五组： 125mg/10ml 另设一个阴性对照组 各剂量组小鼠灌胃容量计算: V D X
制剂长期毒性研究技术指导原则
制剂长期毒性研究技术 指导原则 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
北京市医疗机构制剂长期毒性研究 技术指导原则 一、概述 长期毒性研究可为医疗机构制剂（以下简称“制剂”）的研发提供重要的安全性参考信息，是非临床安全性评价的重要内容。通过长期毒性研究，可预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量毒关系和时毒关系、可逆性等；判断受试物长期给药的毒性靶器官或靶组织；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；提示临床试验中需重点监测的指标；提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药制剂、化学制剂的长期毒性试验研究。 二、一般要求 长期毒性研究应遵守《药物非临床研究质量管理规范》，遵循毒理学研究中随机、对照、重复的基本原则进行试验设计和开展研究工作。 研究机构必须具有法人资格，具备从事药物安全性评价的相关设备、设施及资质，必须取得相应实验动物使用许可证，具有与所使用的实验动物级别相符的实验环境。 试验项目负责人必须获得相关专业领域副高级以上职称（含副高），所有参加研究的人员必须经过相关专业的业务培训。 三、基本内容 制剂的开发背景和研究基础各不相同，在长期毒性研究立题之前应进行文献查阅，根据申报品种的立题依据、临床意义、处方来源、使用历史、有效性与安全性等背景资料进行综合考虑。 （一）试验项目的选择 1.制剂注册申请
（1）中药制剂若满足以下全部条件，可免于进行长期毒性试验： ①根据中医药理论组方； ②处方中的药味用量不超过法定药品标准规定； ③处方组成中不含有法定标准中标识有毒性及现代毒理学证明有毒性的药材（毒性药材是指历版中国药典，部颁标准，进口药材标准，省、自治区、直辖市的中药材标准中标注为大毒/剧毒和有毒的药材，如制附子、制川乌、制草乌等）； ④处方组成不含有十八反、十九畏配伍禁忌； ⑤利用传统工艺配制（即制剂配制过程没有使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化的）； ⑥急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应； ⑦临床实际用药周期为1周以内。 实际用药周期超过1周者，如符合上述条件，且该处方在本医疗机构具有5年以上（含5年）使用历史、能提供可靠的临床安全性资料，亦可免于进行长期毒性试验。 （2）申请配制的化学制剂属已有同品种获得制剂批准文号的，可免于进行长期毒性试验。 （3）本医疗机构已有品种的改剂型品种，如果配制工艺无质的改变且临床用量、给药途径相同，可以免报长期毒性研究资料（缓释、控释制剂除外）。否则，应按临床拟用途径比较改变前后的长期毒性反应。 （4）化学制剂注射剂品种，参照新药的注射剂相关研究技术要求进行试验研究，提供申报资料及文献资料。 2.制剂补充申请
实验二 经口急性毒性试验
毒理学实验二经口急性毒性试验 一、实验目得 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LＤ５０得试验设计原则 3、小鼠得经口灌胃技术 二、试剂与材料 1、实验动物: (1)动物品种:健康成年IＣR小鼠,体重18g～22g (2)样品来源:首都医科大学实验动物部 2、器材:注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂:敌敌畏(1400mg/ｍｌ)、苦味酸染液(标记用)。 三、实验内容 1、健康实验动物得选择与性别鉴定 选择健康得雄性小鼠(健康标准:毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎,废弃。) 肛门与生殖孔距离:大者为雄性,小者为雌性 2、实验动物称重、编号与随机分组 选择体重在1８-22 g得小鼠,采用随机分组得方法(动物按体重分为几个体重段,再从每个体重段分出各组动物),每组10只小鼠,用黄色得苦味酸饱与液标号１ ~9,10号小鼠不标记、 3、受试化学物溶液得配制 (1)确定灌胃量:0、１mｌ/10ｇ (2)确定最高给药量,计算溶液浓度,估计给药总体积 (3)药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定,右手持灌胃器,插入动物口腔,沿咽后壁徐徐插入食道,深度为口腔至剑突得距离。 5、毒性体征得观察与LＤ５０计算 (１)毒性体征得观察: 染毒后注意观察小鼠中毒得发生、发展过程及死亡数与死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间,记录死亡情况及时间,观察期为３0 min （2）ＬD５０得计算: ａ、实验各组剂量得确定:设5组,每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为: ｄ为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD０依次加d,取反对数,即可得出各组剂量。 b、LD5０得计算(见附件):
毒物急性毒性分级标准
毒物急性毒性分级标准文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
表工业毒物急性毒性分级标准 毒性分级 小鼠一次经口 LD 50(mg/kg) 小鼠吸入2小时 LC 50(ppm) 兔经皮 LD 50(mg/kg) 剧毒 高毒 中等毒 低毒 微毒 <10 11~1000 101~1000 1001~10000 >10000 <50 51~500 501~5000 5001~50000 >50000 <10 11~50 51~500 501~5000 >5000 表化合物经口急性毒性分级标准 毒性分级 小鼠一次经口 LD 50(mg/kg) 大约相当体重70kg 人的致 死剂量 6级，极毒 5级，剧毒 4级，中等毒 3级，低毒 2级，实际无毒 1级，无毒 <1 1~50 51~500 501~5000 5001~15000 >15000 稍尝，<7滴 7滴~1茶匙 1茶匙~35g 35~350g 350~1050g >1050g 表外来化合物急性毒性分级(WHO) 毒性分级 大鼠一次经 口 LD 50(mg/kg) 6只大鼠吸入 4小时，死亡 2~4只的浓度 (ppm) 兔经皮 LD 50 (mg/kg) 对人可能致死的估计量 总量 g/kg(g/60kg) 剧毒 高毒 中等毒 低毒 微毒 <1 1~ 50~ 500~ 5000~ <10 10~ 100~ 1000~ 10000~ <5 5~ 44~ 350~ 2180~ <0.05 0.05~ 0.5~ 5~ >15 0.1 3 30 250 >1000 联合国世界卫生组织推荐了一个五级标准。
长期毒性
二、 动物 本试验选用两种动物大鼠和狗,均购自锦州医学院实验动物中心。经过一周检疫和适应 ,选择一般状况良好的动物用于试验。分组时称量体重 ,雄性大鼠重1 2 2.7 士 2 9.5 g,雌性大鼠重 13 6.8 土 2 6.7 g ;雄狗重1 0.8 土 2.7 k g,雌狗重9.9 士 2.6kg。 试验方法 1.分组 鉴于急性毒性试验的给药量超过了限度试验的剂量(小白鼠注射给药超过0.2 g/100 k g), 可考虑只设一个剂量组。另外,文献报告一次静脉给药的最大容量,大鼠和狗分别为0.l m l/10g 和20 m l / 只因此,本试验确定设二个剂量组:低剂量相当于上述最大容量(大鼠为10m l / k g,狗为l.7 m l / k g),高剂量则根据予试验的结果再扩大5、7倍(大鼠为4 5 m l/ k g,狗为1 3 m l / k g)。为了比较,同时设生理盐水对照组(大鼠一次静注4 5m l / k g,狗为13 m 】/ kg )。分组时将雌雄大鼠和狗按体重分层,再随机分配。大鼠每组雌雄各1 0 只,狗为各2只。 2 给药方法 连续2 8 天,每天一次,按规定剂量给动物静注复方甘油注射液。注射速度1 5 ~ 2 0m l /m i n。注射部位,大鼠取尾静脉,狗取后肢小隐静脉。 3 观察与检查 3.1 一般症状观察、体重和进食量测定每天午前、午后两次仔细观察动物的外形、活动有无异常。每周一次测定动物体重和进食量。 3.2血液学及血液生化检查 试验开始前一天及连续.给药 1 4、2 8天后,各对动物进行一次检查.血液学指标为:红细胞计数、血红蛋白、白细胞总数及分类、血小板计数。血液生化指标有:谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮及血清钠。采血方法,大鼠,头两次以钳取眼球法,末次以断头法取血,狗则三次都是从后肢小隐静脉取血。每次采血前须让动物断绝饮食8 小时,目的减轻药物对血液稀释的影响。 3.3 心电图检查 试验前后给每只狗各做一次心电图( l导联) 检查。由于狗的心电图所受影响因素较多,个体间变异很大,而同一只狗在不同时间却变化较小的特点,故以同一狗前后自身对照为基础,判断雌雄狗不同组别的心电图波形变化之大小。 3.4 病理学检查 试验期终了,将所有狗及被抽检的大鼠(每组取雌雄大鼠各4只)以放血法快速处死。随即解剖,首先肉眼观察殉和大鼠各种内脏器官有无异常,继而摘出并称量不同性别、不同组别动物的心、肝、脾、肺、肾、脑的湿重,依据解剖当日的动物体重计算各种脏器的相对重量一脏器系数(g 100g B.W.)。最后,将上述器官连同胃和小隐静脉等一并施行 1 0 肠福尔马林固定,石腊包埋,H E 染色,光学显微镜观察。 试验结果与讨论 1 一般症状 试验过程中,大鼠或纯的不同组别间, 其外形和活动,如眼、耳、鼻、皮肤、粘膜、呼吸、进食、大小便、姿势等未见有明显差别。低剂量组雌鼠中,在第二次钳取眼球后有一只于翌日死亡,可能是失血过多引起的 2. 体重与进食量 曾先后四次测定雌雄大鼠或狗的不同组别的平均体重和进食量,结果发现同种属、同性别、不同组别间的体重增长大致相同,狗呈体重增长抑制倾向,而大鼠的体重则呈负增长
急性毒性试验
试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。 一、啮齿类动物单次给药的毒性试验 （一）试验条件 1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。 2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。 3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 （二）试验方法： 由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。 1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。 3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。 4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。
毒理学指标及试验操作汇总
. 药物毒性试验指标 1.急性毒性试验 一、半数致死量（LD50）的测定 (一)目的:观察受试物一次给予动物后，所产生的毒性反应和死亡情况。 (二)动物分组和剂量 1.动物:一般用小白鼠8周龄，体重18---22g(同次试验体重相差不超过2g)大白鼠6~8周龄，体重120--150g，同次试验体重相差不超过10g。 2.受试物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混悬液. (三)试验方法 1.剂量:一般选用3一5个剂量，各剂量间剂距根据受试物情况和预试结果而定。 2.给药途径和容积: 给药途径:应与临床试验的途径相一致。口服药物应灌胃给药，一、二类新药应采用两种途径给药，其中一种应为推荐临床研究的给药途径。水溶性好的药物还应测定静脉给药的急性毒性。 给药容积:小白鼠禁食(12~16小时)，不禁水，按体重计算:灌胃(ig)不超过0. 4ml/ 10g体重。大白鼠禁食(12~16小时)，不禁水、灌胃(ig)，不超过3ml/只。 3.测定LD:将动物按体重随机分组，每组至少10只(雌雄各半)。给受试物后立即观察50动物反应情况，每天观察一次连续观察七天。详细逐天记录动物毒性反应情况及死亡分布，并用适当的统计学方法(申报时应说明方法名称)计算出LD值及95%可信限。50 4.观察毒性反应:给受试物后应严密观察反应情况，并记录动物的外观、行为活动、精神状态、食欲(饲料消耗量)、大、小便及其颜色、被毛、肤色、呼吸、鼻、眼、口腔有无异常分泌物，体重变化以及死亡等情况。死亡动物应及时进行尸检，发现病变器官应做病理组织学检查。 若发现中毒反应或死亡率一与动物的性别有明显相关时，则应选择性别敏感的动物进 行复试。 (四)试验报告和结果评价 应详细具体，包括试验日期、动物的规格、性别、数量、受试物来源及含量、试验方法。LD 值及其95%可信限，以及各剂量组的死亡率，或最大耐受量的值及其相当于临床剂量的50倍数.详细报告实验过程中动物出现的中毒表现及致死症状，综合评价受试物毒性大小。 二、最大耐受量（MTD）的测定 方法:受试物可用临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度，最大容积的剂量一次或一日内2~3次给予动物(小白鼠至少20只，雌雄各半)。连续观察七天，记录动物反应情况，以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。计算出总给予药量g/Kg(合生药量g/Kg表示)，推算出相当于临床用药量的倍数。 测定最大耐受量，同样也应严密观察动物毒性反应情况，要求与观察单次给药的毒 性反应相同。 ..
实验二 经口急性毒性试验
毒理学实验二经口急性毒性试验 1、实验目的 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LD50的试验设计原则 3、小鼠的经口灌胃技术 二、试剂和材料 1、实验动物： （1）动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g～22g （2）样品来源：首都医科大学实验动物部 2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记用）。 3、实验内容 1、健康实验动物的选择和性别鉴定 选择健康的雄性小鼠（健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。） 肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性 2、实验动物称重、编号和随机分组 选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法（动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液标号1~9,10号小鼠不标记。 3、受试化学物溶液的配制 （1）确定灌胃量：0.1ml/10g （2）确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积 （3）药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。 5、毒性体征的观察和LD50计算 （1）毒性体征的观察：
染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min （2） LD50的计算： a、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为： d为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD0依次加d，取反对数，即可得出各组剂量。 b、LD50的计算（见附件）： C、求半数致死量的95%可信区间 4、实验过程 1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A组和B组)，分别在不同实验室。每大组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组10只动物。 集体活动：1、 2、 3、 4、5 组各1人，进行受试物配制。 各小组活动： 每小组1人（共4人），进行动物标记。（1-10号） 每小组1人（共4人），进行体重记录。（1-10号） 每小组1人（共4人），进行灌胃。（1-10号） 每小组1人（共4人），根据体重吸取受试物（0.1ml/10g）
鱼的急性毒性试验
鱼的急性毒性试验 一、实验目的和要求： 通过本试验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程。 二、实验原理： 鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效成都，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。 三、实验材料： 1.实验鱼的选择和驯养 12×6 小锦鲤鱼体长7-12cm 体宽3-5cm 体重 7-12g 不同浓度的苯酚（mg/L）0、24、48、96、192、384 2、实验仪器设备 （1）实验容器 实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水槽。容器体积可以根据试验鱼的体重确定，通常以每升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类幼鱼可选择500ml 或1000ml烧杯为实验容器。容器的深度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所有毒性残留物。 （2）其他 吸光光度计 3、实验用水：曝气水 四、操作步骤： 1、设置5个浓度组，1个空白对照组，选择不同浓度的苯酚（mg/L）0、24、48、96、 192、384。每个浓度放入12条小锦鲤鱼。采用直接投毒方式，将配制的苯酚溶液直接倒入水槽中，搅拌均匀。分别分为1、2、3、4、5、6组。染毒后观察其活动状况，并
GLP实验室《长期毒性试验SOP》的制定 - 副本
GLP实验室《长期毒性试验SOP》的制定 GLP(Good Laboratory Practice for Nonclinical Safety Studies Practice)即药品非临床研究质量管理规范(亦称优良实验室的质量管理规范）。应用于药品的非临床安全性评价研究的实验室，其目的作用是为了提高药品非临床安全性评价研究（即毒理学研究）的质量，确保实验资料的真实性、完整性和可靠性，最大程度排除由于偶然的误差带来的影响，尽早发现和改正这类错误，并在事后纠正和追究其原因。GLP的基本精神在于怎样减少人为误差，以得到可信性高的实验数据，以保障人民用药安全[1]。 我国药品非临床研究质量管理规范分九章37条，主要内容有：组织机构和人员、实验设施、仪器设备和实验材料、标准操作规程、研究工作的实施、资料档案和监督检查 [2]。非临床研究，系指在实验室条件下，用实验系统进行的各种毒性试验，包括单次给药的毒性试验、反复给药的毒性试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、局部毒性试验、免疫原性试验、依赖性试验、毒代动力学试验及与评价药物安全性有关的其它试验。非临床安全性评价研究机构，系指从事药物非临床研究的实验室。 一、标准操作规程(SOP) SOP是GLP实验室质量体系中重要的部份，是建立质量体系的体现，对质量体系的运行起着至关重要的作用。GLP实验室的日常工作几乎无一例外地建立在以SOP为核心的基础之上。因此，必须对SOP进行有效的控制和管理，这是GLP实验室工作顺利实施的重要保证。SOP的控制和管理是指对SOP的制订、分类、审批、发布、登记、分发、修订／废弃、回收／销毁的整个过程实施控制和管理，其目的是确保SOP在其所适用的备个有关场所始终保持现时的有效性[3]。 1、标准操作规程主要包括以下方面： （一）标准操作规程的编辑和管理； （二）质量保证程序； （三）供试品和对照品的接收、标识、保存、处理、配制、领用及取样分析； （四）动物房和实验室的准备及环境因素的调控； （五）实验设施和仪器设备的维护、保养、校正、使用和管理； （六）计算机系统的操作和管理； （七）实验动物的运输、检疫、编号及饲养管理； （八）实验动物的观察记录及实验操作； （九）各种实验样品的采集、各种指标的检查和测定等操作技术； （十）濒死或已死亡动物的检查处理； （十一）动物的尸检、组织病理学检查； （十二）实验标本的采集、编号和检验； （十三）各种实验数据的管理和处理； （十四）工作人员的健康检查制度； （十五）动物尸体及其它废弃物的处理； （十六）需要制定标准操作规程的其它工作。 2、制订SOP的方法 SOP的基本格式包括SOP的名称、编号和版本、拟订人、审核人、批准人(签名和日期)、颁发和生效日期、适用范围、规程及参考文献等。所有SOP文件必须有系统的编码及修订号, 以便于识别、控制及追踪, 同时可避免使用或发放过时的SOP。系统性: 统一分类、编码并指定专人负责给定编码, 同时进行记录; 准确性: SOP应与编码一一对应,一旦某一SOP终止使用, 此SOP编码即告作废, 并不得再次启用; 可追踪性: 根据SOP编码系统规定,可随
长期毒性实验
长期毒性试验操作规程 1.目的： 观察连续重复给予受试物对动物所产生的毒性反应，首先出现的症状和严重程度，毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况。确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。 2. 动物和材料： 2.1动物 一类新药首选Beagle犬和猴类，应写明供应单位。根据试验周期的长短，一般选择性成熟青年动物为受试动物。二、三、四类新药要求放松一些，但要根据实际情况选择合适的实验动物。 实验前大动物应检测心电，并做血液学和血液生化学分析，指标在正常范围内的动物，方可作为受试动物。 小动物分组方式通常采用随机分组，雌雄各半。大动物通常每组动物4-6只，雌（无孕）雄各半，随机分组。 2.2 受试物和实验室 3.试验方法 3.1 剂量和分组 3.1.1 一般设2-3个剂量组，一类新药应设三个剂量组和一个对照组。剂量一般用g（或mg）/kg或单位/kg表示。低剂量组略高于临床试验人用日最高剂量或按体表面积折算的动物药效学有效剂量。低剂量组不应出现毒性反应。高剂量组原则上应产生明显或严重的毒性反应或个别动物死亡。在高、低两个剂量之间按等比关系再设置一个中剂量。 3.1.2 对照组不给受试物仅给等容量的溶媒或赋形剂。如这些成分可能有毒性时，应另设一组对照组。 限度试验：如果经小鼠急性毒性口服给药剂量大于5g/kg或注射给药剂量大于2g/kg仍不出现毒性反应和死亡或仅个别动物有毒性反应时，可考虑只作一个高于临床拟用剂量50倍的剂量。 3.2 给药途径与方法 3.2.1 给药应与临床用药途径一致。 3.2.2 口服药途径每天于喂食前定时给予。若将受试物混在饲料、水中给予，每动物应分笼饲养，并采取严格有效措施，以保证每只动物按量在一定时限内服完。 3.2.3 经静脉、肌肉或皮下途径，其注射部位可于四肢或臀部等处交替进行。 3.2.4 受试物最好是每周7天连续给予，如试验周期在90天以上，可考虑每周给药6天，每天定时给药。每周可根据体重情况调整给药量，按等容量不等浓度配制药物。 4 试验周期 4.1 长毒试验的给药时间为临床试验用药期的二-三倍，最长半年。 4.2 三、四类新药均符合法定标准；可先做大鼠长期毒性试验。如无明显毒性反应可免做大动物如Beagle犬与猴类等的长期毒性试验。 5. 检查项目 5.1 一般观察：如行为活动、恶心呕吐、流涎、粪便及体重变化情况等。 5.2 检测项目： 5.2.1 心电检查（必要时做）： 5.2.2血液学指标：红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血时间。 5.2.3 血液生化学：天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（Crea）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、
犬的长期毒性试验
试验药物:cpu2013由四川省中药研究所提供，批号961214，每克提取物相当于66.67克。将cpu2013药粉溶于蒸馏水中，按等容积不等浓度配制大、小两个浓度。 1.2 动物:Beagle犬18只，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：医动字第01-3042号，6～8月龄，雌雄各半，体重9.28±0.91kg，分笼饲养观察3周后用于试验。Beagle犬专用膨化饲料购自军事医学科学院实验动物中心饲料厂。 1.3 试剂及仪器:所有试剂均购自北京中生生物工程高技术公司。心电图机为上海医用电子仪器厂产品，型号XDH-3B。电子天平由北京市菲姆斯科技开发公司生产，型号ACS-2EAS，(95)量字京字00000268。全自动血常规分析仪为日本生产，Sysmex F-820型。全自动血生化分析仪由日本Olympus公司生产，型号AU600。 1.4 剂量及分组:用配对分层随机法按体重分组编号将24只犬分为4组，每组6只，雌雄各半，分别每天给同体积药液或蒸馏水。 1.5 受试环境中国中医研究院西苑医院实验动物中心，医学实验动物环境设施合格证：京动管犬字(97)第002号。饲料、饮水、垫料均符合《北京市实验动物质量控制标准》。 1.6 实验方法犬在室温24±3℃条件下，饲养驯化3周适应环境，每日定量摄食300克，每日各组按规定剂量给药1次，一周给药6天。给药前、给药第8周末、第16周末、第24周末、停药2周末各组动物记录心电图，静脉取血检测各项血液学及生化指标。给药24周结束后，各组4只动物记录心电图、取血检测各项指标、活杀进行病理检查。
各组剩余的2只动物停药观察2周末记录心电图、取血检测各项血液学及生化指标、活杀进行病理检查。 1.7 观察指标 1.7.1 一般状态观察每天观察给药后的反应、外观、活动状态精神状态、摄食、饮水、皮毛、呼吸、口眼鼻耳分泌物情况及大小便情况。 1.7.2 体重 每周测量体重，比较各组差异。 1.7.3 血常规检查指标 红细胞计数(RBC)、血红蛋白含量(Hb)、白细胞总数加分类(WBC、W-SCR、W-LCR)、血小板总数(PLT)、凝血时间(CT)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(HCHC)、红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)、平均血小板体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)。 1.7.4 血生化指标 血糖(GLU)、胆固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、转肽酶(GGT)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、阿法羟丁酸脱氢酶(HBD)、肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐(Cr)、总胆红素(TBil)、血清钙离子浓度(Ca)、血清磷离子浓度(P)。ALT、AST采用IFCC(即国际临床化学联合会)酶法，GGT、LDH、CPK、ALP、HBD、GLU、BUN采用酶法，ALB 采用溴甲酚绿法，TP采用双缩尿法，TBil采用重氮法，TG采用GPO-PAP
实验二经口急性毒性试验
实验二经口急性毒性试验 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
毒理学实验二经口急性毒性试验 一、实验目的 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LD50的试验设计原则 3、小鼠的经口灌胃技术 二、试剂和材料 1、实验动物： （1）动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g～22g （2）样品来源：首都医科大学实验动物部 2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记用）。 三、实验内容 1、健康实验动物的选择和性别鉴定 选择健康的雄性小鼠（健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。） 肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性 2、实验动物称重、编号和随机分组
选择体重在18-22 g 的小鼠，采用随机分组的方法（动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液标号1~9,10号小鼠不标记。 3、受试化学物溶液的配制 （1）确定灌胃量：0.1ml/10g （2）确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积 （3）药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。 5、毒性体征的观察和LD50计算 （1）毒性体征的观察： 染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min （2）LD50的计算： a 、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为： 1 lg lg d 0 100--=组数LD LD
犬长期毒性试验及急毒试验
犬长期毒性试验 犬试验计划书 2﹑试验目的本研究对Beagle犬连续口服给予供试品盐酸氯苯哌酮9个月，考察犬产生的主要毒性反映及其严重程度，判断其毒性靶器官或靶组织及其毒性的可逆性和迟发性，提供毒性反映计量，为临床设计人用计量及临床毒副反映的监测提供参考依据。 3﹑准则和参考文献《化学药物长期毒性试验技术指导原则》；国家食品药品监督管理局2003年9月1日施行。 4﹑遵从GLP <药物非临床研究质量管理规范>单位及施行日期 5﹑试验机构 试验机构： 机构地址： 电话： 传真： 6﹑委托单位及联系人 委托单位： 单位地址： 联系人： 联系方式： 7﹑机构负责人﹑项目负责人及试验相关人员
机构负责人： 项目负责人： 兽医： 饲育管理： 病理负责人： 8﹑质量保证 QAU负责人： QAU检查人： QAU将检查试验计划书和试验操作，以确保试验计划书及其修改页﹑标准操作规程实施，并符合GLP的要求。在将试验结果和报告发送给委托单位之前，项目负责人将原始记录和报告草稿交QAU检查，以确保最终报告能够准确反映试验结果。QA检查的结果将发送给项目负责人和机构负责人。 9﹑供试品 名称： 批号： 物理性状： 提供单位： 含量： 防护措施：常规 贮存条件： 贮存地点：
剩余供试品处理： 10﹑试验日程（待定） 接受样品 试验启动时间 预计试验开始时间 引入动物 试验前第一次采血 试验前第一次生理（心电图、体温）试验前第二次采血 试验前第二次生理 试验前眼底检查 分组 给药开始 试验期间第一次采血 试验期间第一次生理 试验期间第二次采血 试验期间第二次生理 投药末眼底检查 投药末采血 投药末生理 投药末解剖及采尿 恢复期眼底检查
急性毒性试验[1]
实验一急性毒性试验(Acute Cytotoxicity Test) 一、实验目的： 了解生物材料急性毒性的含义，掌握急性毒性试验的基本方法。 二、实验原理： 医学上通常指的急性毒性试验是对药物而言的，并以半数致死量（median lethal dose, LD50）来衡量药物急性毒性的大小。所谓LD50是指某一药物使试验动物总体死亡一半的剂量，由于LD50是剂量反应曲线上最敏感的一点，而且有易测、准确和重复性好的优点，以此作为药物使用的安全指标。但对于生物材料而言，它与药物在体内的反应机理不同，大多数生物材料不能计算LD50，所以在试验过程中，通过对实验动物进行动物静脉或腹腔注射试验材料或其浸提液来观察实验动物体重在24、48和72h的变化、运动、呼吸状态以及死亡情况作为评价的指标，判定某种生物材料的急性毒性作用。 三、实验对象：小鼠 四、实验器材和药品： 聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA），蒸馏水，生理盐水（0.9％），注射器（1ml），量筒（10ml），小烧杯（50、100ml），高压消毒器。 五、实验步骤： 1．浸提液制备： 按评价标准裁剪试样，选择适当浸提温度制备浸提液。 2．将10只体重在17～23g间的健康、未做过其他实验的小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只。 3．将浸提液按每公斤小鼠体重注射50ml于实验组小鼠尾静脉（50ml/kg），用生理盐水按同样方法作空白对照。 4．记录试样表面积和使用浸提液的容量；记录注射后24h、48h、72h两组小鼠的体重，观察其各种生物学反应情况。 六、评价方法：
2．结果判断标准： 2．1 在72h观察期内，注射材料浸提液的动物反应不大于对照组动物，则认为该材料符合急性毒性试验要求。 2．2在72h观察期内，注射材料浸提液动物中有2只以上出现轻度毒性症状或仅1只动物出现明显毒性症状死亡，或实验组5只动物的体重均下降，即使无其他中毒症状都要进行重复试验。 2．3 重复试验的动物数量应加倍，即每组需10只小鼠。浸提液应该重新制备。重复试验若符合2．1 项要求，则认为该材料合格。 2．4 如实验组动物有2只以上发生死亡或3只以上出现明显毒性症状或动物普遍出现进行性体重下降，则不需要重复试验，可认为该材料不符合急性毒性试验要求。 附：小鼠静脉注射方法 小鼠的尾部有三条静脉，一般采用两侧的静脉。把动物固定在暴露尾部的固定器内（可用烧杯、铁丝罩或粗试管邓物代替固定器）。拔去尾部静脉走向的毛，置尾巴于40～500C 温水中浸泡几分钟，或用75％乙醇棉球反复擦抹，使尾部血管扩张。行尾部注射时，尽量采用与尾部平行的角度进针，抽吸法不能验证是否穿刺成功，开始注药时应尽量缓慢，仔细观察，如果有白色皮丘出现，说明未刺入血管，应重新向尾部方向移动针头，再次穿刺，直至注射时无皮丘出现，才能正式注射药物，有时在注射药物的同时可见静脉血被进去的药物向前推进。 实验二致热源试验(hypersusceptibility test) 一、实验目的： 掌握致热源实验的基本方法。 二、实验原理： 致热源试验是通过被测材料或其浸提液注入实验动物体内，若浸提液存在热源物质，作用于单核细胞、巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内出性热源，作用于丘脑体温调节中枢，使动物体温上升，因此，观察动物的体温变化可用来判断该材料或其浸提液中所含热源量是否符合人体的要求。 三、实验对象：兔 四、实验器材和药品： 硅橡胶、蒸馏水、生理盐水（0.9℅）、注射器（50ml）、烧杯(150ml)、量筒（100ml）、高压消毒器、体温计（肛测）。 五、实验步骤： 1．浸提液制备： 1.1将所有与浸提液接触的容器、量器等玻璃器皿均应先置于干燥箱内250℃加热30min，或180℃加热2h去除热原物质。 1.2 浸提液所用灭菌0.9℅生理盐水应是热原检查合格者，试样浸提前应用同一批号灭