第18章 色谱分离原理

四、溶质保留方程
• 保留因子k (retention factor) • 容量因子 (capacity factor) （分配比） – 在平衡状态下组分在固定相与流动相 中的质量之比 k = ns / nm
四、溶质保留方程
• 溶质通过色谱柱的速度或保留值的大小是由每一 瞬间该溶质在流动相中的分子分数决定的。 • 设流动相的平均流速为 u，溶质 x 谱带在色谱柱 中的移动速度为 ux ux = Ru
第18章 色谱法导论
• • • • • 18-1 概述 18-2 色谱基本术语 18-3 色谱法基本理论 18-4 分离度 18-5 定性和定量分析
18-1 概述
• 色谱发展简史 • 色谱法在工业生产和科学研究中的作用 • 色谱法的定义与分类
一、 色谱发展简史
• 色谱法的出现 • 色谱法的发展 • 色谱法的现状和未来？
橄榄油有机酸
液相色谱－液相色谱联用
液相色谱－液相色谱联用模式
• 同模式 LC–LC • 多模式 LC–LC • 全二维 LC
– (i) 样品的每一部分均经过二维分离。 – (ii)样品的所有组分等比例经过二维分离。 – (iii) 第一维具备分离能力。
全二维 LC
固相微萃取技术
Fig.1-2 SPME construction
R为溶质 x 在流动相中分子数与总分子数之比
四、溶质保留方程
nm R nm ns
• 流动相平均流速u和溶质谱带移动速度ux
L u tM
L ux tR
四、溶质保留方程
ux R u nm L L tR nm ns t M 1 1 1 ns t M tR 1 nm k tR tM t' R tM tM
按固定相的使用形式分类
• 柱色谱 (column chromatography) • 平板色谱 (planar chromatography) – 纸色谱 (paper chromatography) – 薄层色谱 (thin layer chromatography)
按流动相的物理状态分类
• 气相色谱 – 气固色谱 – 气液色谱 • 液相色谱 – 液液色谱 – 液固色谱 • 超临界流体色谱
高效液相色谱仪
毛细管电泳仪
液相色谱分离速度的变化
色谱法的现状和未来
• 气相色谱和高效液相色谱发展最好
• 超临界流体色谱处于失利地位 • 毛细管电泳与毛细管电色谱处于研究阶 段,进入部分应用领域
气相色谱和高效液相色谱发展最好
• 气相色谱仪及备件 – 全球市场: 约10亿美元/年; 3-4%年增长 • 高效液相色谱仪及备件 – 6-8%年增长
A.J.P. Martin
R.L.M. Synge
气相色谱仪
色谱法的发展
• • • • • 1957年Goley开创了毛细管气相色谱 1960年代末出现高效液相色谱法 1980年代超临界流体色谱得到发展 1980年代Jorgeson发展了高效毛细管电泳 1990年代后期毛细管电色谱得到重视和 发展
超临界流体色谱处于失利地位
• 发展晚于GC和HPLC • 虽然具有一些独特用途，但大多数功能 可由GC和HPLC代替
毛细管电泳与毛细管电色谱
• 为基因组学研究作出了杰出贡献 • 目前存在的主要问题： – 分析结果偏差大 – 比HPLC大一个数量级 • 机遇：分离分析生物大分子
成功的定量分析方法应具备的基本条件 • 易于使用，操作费用低
• 与传统电泳技术及现代色谱技术相比：
– 仪器简单、操作方便、易自动化
– 分离效率高(105 - 107 块/m) 、分析速度快
– 操作模式多
– 实验成本低，消耗少
– 重现较差，分析结果误差大
毛细管电泳示意图
多维气相色谱
全二维气相色谱
全二维气相色谱
液相色谱－气相色谱联用
液相色谱－气相色谱联用
按流动相和固定相的极性不同
• 正相色谱 （流动相极性小于固定相） • 反相色谱 （流动相极性大于固定相）
按用途不同分类
• 分析型色谱 • 制备型色谱 • 流程色谱
18-2 色谱基本术语
多环芳烃HPLC色谱图
一、基线（baseline)
• 仅有流动相通过时，检测器响应信号的 记录值
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、峰高
h
色谱法的发展
• 1931年 Kuhn 等用氧化铝和碳酸钙分离了α -
,β -,γ -胡萝卜素等60多种植物色素
• 1941年 Martin 和 Synge建立了液液分配色谱法
并提出气相色谱的设想
• 1952年 Martin等发明了气液色谱法
• 1952年 Martin 和 Synge 获得诺贝尔化学奖
三、保留值
• 调整保留时间 (t’R)和调整保留体积(V’R)
t’R = tR - tM (溶质在固定相中停留的总时间)
V’R = VR - VM
三、保留值
• 相对保留值 (2,1) relative retention – 在一定色谱条件下两个组分的调整保留时间 （体积）的比 2,1 = t’R2/t’R1 • 分离因子 () separation factor = t’R2/t’R1
五、区域宽度
• 标准偏差 • 半峰宽 Y1/2 • 基线宽度 Y
色谱流出曲线
标准偏差
半峰宽 基线宽度
半峰宽度、基线宽度 与标准偏差的关系
Y1 / 2 2.354 Y 4
18-3 色谱法基本理论
• 色谱分离过程 • 塔板理论 • 速率理论
色谱分离过程
改进分离的两种途径
塔板理论(Martin &Synge)
解：（1）组分B对A的相对保留值 rB/A=tB’/tA’=(25-2)/(18-2)＝1.44 （2）组分A,B的保留因子 rA=(18-2)/2=8.0 rB=(25-2)/2=11.5 （3）组分B通过色谱柱在流动相保留的时间是tM=2min；在固定 相保留的时间tB’=25-2=23min。各占保留时间分数的8％和92％。
色谱法的出现
• 1903年 Tswett （茨维特）研究植物叶子组成时发明了 色谱法
色谱法的出现
• 1903年 Tswett （茨维特）研究植物叶子组成时发明了 色谱法
1906年 Tswett 的研究成果发表
• • • • • • Chromatographie (德语） Chromatography (英语） 色谱 玻璃管=“色谱柱”column 碳酸钙=“固定相”stationary phase 石油醚=“流动相”mobile phase
发展趋势
• • • • • 进一步发展高效分离技术 小型化、微型化、自动化 各种联用技术 样品处理技术 高通量
超高效液相色谱（UPLC）
chromatogram obtained under isocraticconditions on a 43 cm long capillary column packed with 1.0 µm non-porous C18 particles (Eichrom Scientific).
固相微萃取技术
Fig.1-5 Desorption chamber for coupling SPME to HPLC
Fig.1-6 Commercially available interface of SPMEHPLC (Supelco)
固相微萃取技术
固相微萃取技术
固相微萃取技术
Monolithic capillary
三、保留值
• 死时间 (tM) 和保留时间 (tR)
三、保留值
死体积 (VM) 和保留体积 (VR) – 死体积: 色谱柱中不被固定相占据的空间以及进样 系统管道和检测系统的总体积 （VM = tM Fc） – 保留体积: 从注射样品到色谱峰顶出现时，所通过 色谱系统的流动相体积 （VR = tR Fc）
超高效液相色谱（UPLC）
The sample was run using constant-flow pumps at 52 000 psi on a 38cm long capillary packed with 1.0 µm C18 particles.
芯片液相色谱
ZORBAX 300SBC18 5 µm particles H.-F. Yin et al., presented at the 18th International Symposium on Microscale Separations and Analysis, HPCE, San Diego, January 2003.
•
k
溶质保留方程
t
四、溶质保留方程
• 分离因子 = t’R2 / t’R1 = k2 / k1 • 分配系数 K
Cs n s / VS K C m n m / VM VS kK K VM
• 称为相比*
四、溶质保留方程
• 根据保留体积与保留时间的关系
k = (VR-VM)/VM
VR = KVS+VM
习
题
假如一个溶质的分配比为0.2，则它在色谱柱的流动 相中的百分率是多少？
∵ k = ns/nm=0.2 ∴nm= 5ns
nm/n×100% = nm/(nm+ns)×100% = 83.3%
在某色谱条件下，组分A的保留时间为18min，组分B的 保留时间为25.0min，其死时间为2min，试计算： （1）组分B对A的相对保留值； （2）组分A,B的保留因子； （3）组分B通过色谱柱在流动相、固定相保留的时间是 多少？各占保留时间分数为多少？
专利申请号：200520095986.1
固相微萃取技术
三、 色谱法的定义与分类
• 色谱法是一种物理化学分析方法，它利 用混合物中各物质在两相（固定相和流 动相）间的分配系数的差别，当两相作 相对运动时，各物质随流动相运动，并 在两相间进行多次分配，从而使各组分 得到分离。
色谱法的分类
• • • • • • 按固定相的使用形式 按流动相的物理状态 按分离机理 按色谱操作方式不同 按流动相和固定相的极性不同 按用途不同分类
面临的问题
• 当今化学、生命科学、环境科学等研究 领域中备受人们关注的热点问题，如蛋 白质组学、代谢组学中的分离分析问题 的解决，医学中的药理、药物代谢研究 和疾病标记物研究，天然产物有效成分 的分离分析，食品安全，毒品、兴奋剂 等快速检测等等。
复杂体系
样品制备
SP(M)E 等
分离
检测
GC, HPLC, CE, CEC, micro-TAS……
多肽分离图
自动化
分离分析新技术简介
• • • • • • 毛细管电泳 全二维气相色谱 液相色谱－气相色谱联用 液相色谱－液相色谱联用 色谱－质谱联用* 样品处理技术
毛细管电泳
毛细管电泳是指溶质以电场为推动力， 在毛细管中按淌度差别而实现的高效、 快速分离的新型电泳技术。
高效毛细管电泳的特点
按分离机理分类
• 分配色谱 (partition chromatography)
• 吸附色谱 (adsorption chromatography)
• 离子交换色谱(ion exchange chromatography) • 排阻色谱 (size exclusion chromatography) • 亲和色谱 (affinity chromatography)
按色谱操作方式不同分类
• 迎头色谱 (frontal chromatography) • 顶替色谱 (displacement chromatography) • 洗脱色谱 (elution chromatography)
洗脱色谱（冲洗）
• 这是色谱过程最常用的方法。将试样加 入色谱柱的入口端，然后用流动相冲洗 柱子，由于各组分在固定相上的吸附 （或溶解）能力不同，于是被流动相带 出的时间不同。
• 色谱柱是由一系列连续的、相等的水平理论塔板组成 • 在每一块塔板(高度H)中溶质可以在流动相与固定相中 迅速达到平衡。H称为理论塔板高度。 • 流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每 次进入的流动相体积为一个塔板体积。 • 所有组分开始时存在于第0号塔板上，且试样的纵向扩 散可忽略。 • 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上 的量无关。
• 能够得到准确、可重复的定量结果 • 要能够解决至少一个分析化学中的重要 问题
色谱法在工业生产和科学研究中的作用
• 1930-1940年代为分离复杂的生物组成发挥了独 特作用
• 1950年代为石油工业的发展作出了贡献 • 1960-1970年代成为石油化工、化学工业等部门 的分析检测手段
• 目前，色谱法已成为生命科学、医药科学、环 境科学、材料科学、食品科学、法庭科学以及 航天科学等研究领域的重要手段