长效干扰素研究进展

干扰素是一 类重要的家 族性细胞因 子, 具有抵 抗 病毒感染, 抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。 IFN 蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体 特异性分为三型: I型包括 IFN-A, -B, -X, -E, -J等亚型; II型干扰素由单基因家族 IFN-C构成, 又称为免疫干扰 素; Ó 型是一种新发现的 细胞因子, 称为 IFN-K。其 中 IFN-A的抗 病毒 活 性最 强, IFN-A分 子的 不 同亚 型 由 165~ 172个氨基酸组成, 分子量约 19kDa左右。
Balan等 [ 8] 设计出一种针对 二硫键的定 点 PEG 修 饰剂, 这种修饰剂可修饰含有二硫键的治疗蛋白, 如各 种细胞因子、抗体、酶等。这种修饰剂修饰蛋白包括两 个步骤: 首先, 将蛋白质中天然存在的二硫键还原成两 个巯基; 然后, 用一个连接有 PEG 链的三碳桥将两个巯 基重 新 连 接 起 来。 他 们 将 用 此 方 法 将 IFN-A2b 用 20kD a PEG 进行修饰, 修 饰后的 PEG-IFN 体外活 性保 留 IFN 活性的 8% , 而 临床上 使用的 PEG- IFN 为 7% 。 用这种方法修饰的 PEG-IFN 在 4e 水溶 液中可以稳定 存在 3 个月, 37e 人血清中稳定存在 30h。小鼠皮下注 射后, 20kD a PEG-IFN 的 半衰期从未修饰前的 1h 延长 为 12h。这种 PEG 修饰方法 不会使蛋 白的活 性降低, 以及影响免疫活性, 是 PEG定点单修饰的有效方法。
中国生物工程杂志 Ch ina B io techno logy, 2010, 30( 5) : 122-127
长效干扰素研究进展
田 硕 1 徐 晨 2* 姚文兵 1
( 1 中国药科大学 南京 210009 2 北京三元基因工程有限公司 北京 102600 )
摘要 干扰素是一类多功能细胞因子, 是由哺乳动物细胞受到适宜刺激产生的一种微量的、具高 度生物学活性的蛋白质, 具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。干扰素 A血浆半衰期短而丙型和乙型肝炎治疗周期长, 影响了患者的依从性。目前延长蛋白药物半衰期 的方法主要有化学修饰、蛋白融合、定点突变技术联合和改造药物制剂释放系统, 随着又一新型 长效干扰素 ZALBIN 即将上市, 长效干扰素再次成为医药行业的聚焦点。现针对干扰素 A长效制 剂中的最新研究进展进行综述。 关键词 干扰素 A 半衰期 定点突变 PEG化 白蛋白融合 中图分类号 Q816
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中国生物工程杂志 China B io techno logy
Vo .l 30 No. 5 2010
ZALB INTM¹ ( alb in terferon alfa-2b, 又名 A lbuferon l ) 是由人类基因科学公司 (H um an G enom e S ciences) 利用 其所有的白蛋白融合技术平 台和诺华公司 ( N ovartis) 合作 开发的 长效 IFN-A2b , 主要 用于治 疗丙 型肝 炎。 如图 1所示, 它 是由人 血清 白蛋白 的 C 端与 IFN-A2b 的 N 端未直接融合, 未通过连接肽而成 的单链蛋白 质 分子。其分子量为 85. 7 kDa。在酵母表达系统中进行 表达。
图 1 ZALBIN 分子结构模示图 [ 12] Fig. 1 M olecu lar model of ZALB IN[ 12]
食蟹猴体内 试验研究显 示: 静脉注射和 皮下注 射 30Lg /kg ZALB IN 后, 清 除半 衰 期分 别为 68h 和 93h。 与 IFN-A相比, 清除率降低 140 倍, 半衰期延长 18 倍。 临床 I期试验在曾用过 IFN-A的患者间进行, 结果显示 安全的成 人用药 剂量 为 1 200Lg, 平 均清 除半 衰期 为 159h, 此结果为间隔 2~ 4 周用药提供依据。临床 Ò 试 验结果显示: I型丙型肝炎患者 在用药剂量为 1 200Lg 时耐受性良好。用药量为 900Lg和 1 200Lg组的 69% 患 者 在 用 药 第 4 周 H CV RNA 减 少 量 超 过 2 log 10 IU /m l。将 ZALB IN 和 Pegasys分别与利 巴韦林联 合 用药进行比较, 它们 在治疗丙型 肝炎的功效 及副反 应 方面水平相当。而 ZALB IN 为 Pegasys给 药剂 量的 一 半, 给药间隔时间长至两周。临床 Ó 期试验分别对 I型 和 Ò 、Ó 型 丙型 肝炎 患者 进行 了试 验研 究, 结 果表 明 ZALB IN 对与 Pegasys的有效性及安全性相当。
FDA 目前批 准的 PEG 化干 扰素: PEG-In tron[2] 和 Pegasys[ 3] , 分别为 PEG 修饰的 IFN-A2b 和 IFN-A2 a, 用 于慢性丙型肝炎和慢性乙 型肝炎的治 疗, 两者生 物性 状比较见表 1。 1. 2 不同类型 PEG 修饰
虽然 PEG 能保护蛋白不被蛋白酶 降解, 延长了血 清半衰期, 但 同时 PEG 化也 导致了 IFN 活 性降 低, 因 此, 筛选适合大小和形状的 PEG 是改善 上述技术缺陷 途径之一 [ 4] 。
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田 硕 等: 长效干扰素研究进展
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表 1 PEG- In tron 与 P egasys比较 Tab le 1 The d ifferen ce b etw een PEG- Intron and Pegasys
中文名 通用名 生产厂家 PEG 分子量
PEG-In tron
2 蛋白融合
蛋白融合是指通过基因重组手段将药物蛋白质基 因与特定的载体蛋白基因 融合, 由同一 调控序列 控制 基因表达产物, 是以基因工程手段人工创造的新分子。 目前为使蛋白获得长效的目的采用最多的载体是 H SA 和抗体 Fc片段。 2. 1 白蛋白融合的长效干扰素
人血清白蛋白 ( H SA )是人体血液中天然的物质输 送载体, 血清中含量最高, 其相对分子量约为 65kD a, 由 585个氨基酸组成的单链球型蛋白质, 无酶学及免疫学 活性, 体内半衰期 长达 19 天, 是 理想的 改善药物 半衰 期的药物融合蛋白 [ 11] 。
P ega sys
佩乐能
派罗欣
PEG-alpha interferon PEG-alpha- interferon
2b
2a
Schering Plough
H offm an-La R och e
12kD a
40 kD a
PEG 结构
直链
PEG 修 饰后 活性 保 留
28%
用药剂量
0. 5 ~ 1. 0Lg / kg /周
近来 B ell等 [ 7] 研发出 PEG 修饰的 IFN 的活性比未 修饰的 IFN 的活性高 2 ~ 3倍, 突破了 PEG 修饰 IFN 后 活性下降的技术瓶颈。 B ell等将 IFN-A2 的 111 位氨基 酸甲 硫 氨酸 突 变为 半 胱氨 酸, 用 分子 量 为 20kD a 和 40kDaPEG-马来酰亚胺 定点修饰该半 胱氨酸。其体 外 抗肿瘤活性是天然 IFN-A2的 2~ 3 倍, 小鼠皮下注射给 药后, 20kD a和 40kDa的 PEG-马来酰亚胺修饰 的 IFNA2 的半衰期分别是天然 IFN-A2 的 26 倍和 38 倍。通 过 对小 鼠 体内 肿 瘤大 小、重量 和 数量 的 检测, 20kDa PEG-马来酰亚胺修饰的 IFN-A2 能够抑制 90% 转入 裸 鼠的人卵巢癌细胞 N IH: OVCAR-3 的生长, 药效明显优 于相当剂量的 IFN-A2。抗病毒活性未见报导。
1. 3 PEG 定点修饰 FDA 批准上 市的两种 PEG 化 干扰素为非 均一产
物。 PEG-In tron是由 14种单修饰和少量未修饰的 IFNA2b组成的混合物, 而 Pegasys为至少 由 6 种单修饰组 成的混合物。这些 导致了产品 质量控 制、工业化 生产 纯化等难题, 而定点修饰可选择特定基团进行修饰, 避 免或减少对活性位点的修饰, 可较好地控制修饰程度, 提高活性保存率。
1 聚乙二醇修饰的长效干扰素
聚 乙二 醇 ( PEG ) [ 1] 是 由环 氧 乙 烷聚 合 而 成, 被
收稿日期: 2010-01-29 修回日期: 2010-03-24 * 通讯作者, 电子信箱: xuchen@ triprim e. com
FDA 批准可用于 药物、食品 和化妆 品的聚 合物。 PEG 共价链接到 IFN-A表面, 使 IFN-A相对 分子量增大, 减 少了肾小球的滤过, 保护 IFN-A不被蛋白酶降解, 同时 挡住 IFN-A表面的 抗原决 定簇, 降低 免疫原 性。 目前 已有 8 种 PEG 化药物获得 FDA 批准上市, 还有十几种 药物处于临床或临床前研究。 1. 1 PEG-In tron和 P egasys
Ram on 等 [ 5] 用平 均分 子量 为 40kD a支链 结构 的 PEG 修饰 IFN-A2b, 单修饰体占 30% ~ 50%, 其余为多 修饰体和未修 饰的 IFN-A2b。纯化 后的单修饰 体纯度 可达 96% , 与 多修饰体 相比保 留了较高 的生物 活性。 然而, 单修饰体 的体外抗病 毒及抗肿瘤 增殖活性 仅保 留 IFN-A2b的 2% 。体内药效学研究显示, 单修饰体表 观分布容积约低于 IFN-A2b 5倍, 而血清半衰期和血浆 内保留时间分别比 IFN-A2b提高了 330倍和 708倍。
Tm ax ( h) a
48 ~ 72
清除半衰期 ( h)
40
支链 7% 180Lg /周 80 65
给药间隔
1周
1周
48周单药 SVR b
23%
48周联 合利巴 韦林
SVR
54%
36% ~ 39% 56%
a: Tm ax为血清中药物达到最大浓度所需时间; bSVR 为持续应答率。
Jo等 [ 6] 研究出了另一种 PEG 修饰方法。用平均分 子量为 43kD a, 三 聚体 结 构的 PEG ( PEG3, 包含 3 条 PEG链 ) 修饰 IFN-A2a。 PEG3-IFN-A2 a的单修 饰率 约 为 25% , 10% 为 双修 饰的 PEG3- IFN-A2a, 60% 为未 修 饰的 IFN-A2 a。单修饰的 PEG3-IFN-A2 a的体外抗病毒 活性为天然 IFN-A2a 的 10% 。因此, 单修饰 的 PEG3IFN-A2 a的体外抗病毒活性要高于 Pegasys。小鼠静 脉 注 射 单 修 饰 的 PEG3-IFN-A2 a 结 果 显 示, 单 修 饰 的 PEG3-IFN-A2a的清半衰 期和血 浆内 保留 时间 分别 比 IFN-A2b 提高了 31倍和 54倍。
IFN-A1b在结构上和 A族其他干扰素有明显不同, 前者在第 86位有第 5 个 Cys。借鉴 IFN-A1b 的分子序 列, 牛晓霞等 [ 9-10] 将 IFN-Con-m l基因的第 86位 T yr残 基突 变 为 Cys 残 基, 在 保 留 原 有 活 性 的 基 础 上 将 m PEG20000 定点偶联到 第 86 位 C ys残 基上。药 代动 力学研究显示: 修饰前干扰素的消除半衰期为 ( 1. 57 ? 0. 34) h, 修饰后的为 ( 18. 0 ? 4. 0) h, 体内半衰期显著 延长。
近 20 年以来, 随着基因工程技术的发展, IFN-A成 为第一个用于临床的 基因重组细 胞因子, 被美国 FDA 批准应用于病毒 性肝炎、癌症及 多发性硬化 症等多 种 疾病的临床治疗已有数年。但是干扰素相对分子质量 较小, 易被肾小球滤 过, 体内不稳 定, 易被血 清蛋白 酶 降解, 血浆 半衰 期短 而治 疗周 期长, 需要 频繁 注射 给 药, 患者依从性降低。因此, 改善重组 IFN-A代谢动 力 学及药效学特征的研究正在广泛进行。主要技术手段 为: 化学修饰技术、基 因融合技术、定点突变 技术以 及 药物传输系统, 下文就 以上技术 在改造 IFN-A的最 新 研究进行综述。