AFP基因表达的检测----长沙小离

退火及延伸 再加入 10x PCR 缓冲液 5 μ l , 25 m M Mg Cl2 溶液 3 μ l , Ta qD N A聚合酶 2u , 加去离子水至总体积 5 0 μ l 。 94 ℃ 变 性 30秒 , 59 . 5 ℃ 退火 30 秒 , 72 ℃ 延 伸 40 秒 , 共进行 30 个循环 , 末次循环 后 72 ℃ 延伸 7 分钟 。 PCR反应循环条件设置：
Taq DNA 聚合酶：在 70 － 75C 具最高活性。具有 5’ －3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功 能。是镁依赖性酶。 引物：PCR反应中引物浓度一般为0.1－0.5 mol/L。
循环条件的设定：
变性：模板 DNA由双链变成单链，使有利于与引物 结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间， 一般情况下94C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全 变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合
RT-PCR
R T - PCR 所用引物由中科院上海生物工程公司合成 , 引物序 列 如 下 : AF P 上 游 引 物 : 5 ' - T G CA GCCA AA GT GA AG A GG G - 3 ' ;AF P 下 游 引 物 : 5 ' - C AA GCT GCT TT CT CTT A AT T C - 3' β - a c tin 上 游 引 物 : 5 ' - T CT A C AAT GA GCT GC GT GT G G - 3 ' β - a c ti n 下 游 引 物 , 5 'G GA ACC GCT CAT T GCC AA T G - 3' 。 β - a c tin 作为内参照 。 同时以 Hep G2 总 P N A 作为阳性对照 、 水 作为阴性 对照进行扩增 , 排除假阳性和假阴性的情况 。
酶活性和dNTP分子造成损害）。
退火：变性的 DNA快速冷却至 40－ 60C可使引物和 模板DNA发生结合。可根据引物的长度和G＋C的含 量选择复性温度。退火时间30秒。 延伸：一般是70－75C，此时Taq DNA聚合酶活性 最高。<1kb，1分钟；>1kb的可适当延长时间。 循环次数：理论上 20 － 25 个循环 PCR 产物的累计即 可达到最大值、实际操作中 25 － 30 较合理。循环次 数越多，非特异性产物的量也会增加。
实验步骤
RNA的提取
RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染
外源RNase的主要来源： 被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等
操作者的手，头发等
防止外源RNase污染的主要措施
1. 当处理RNA时，移液器专用 2. 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液 等留出专用； 3. 溶液和试剂分装成小份保存； 4. RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的 水冲洗）；
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
带评价RNA质量
实验材料：水HCC 患者的外周血单核细胞（PMNCs）
AFP mRNA
提取方法：
1. 外周血单个核细胞( P MNCs) 的分离 取受检者 外周血 5 ml , 肝素抗凝 。采用密度梯度离心法 , 用淋巴细胞分离液分离收集 P MN Cs 。
导致PCR产物很少或无扩增产物的原因
凝胶电泳检测PCR产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带， 应从以下几个方面寻找原因：
1. 点样或染胶问题 2. 反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时 出了问题；
3. 目的片段太大，使用的DNA Polymerase 无法扩增出目的片段；
RNA提取
RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的 调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性 对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子
生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关
键的因素是尽量减少RNA酶的污染。
甲胎蛋白-----作为 原发性肝炎HCC肝 癌微小转移标志物
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：PMNCs的mRNA
实验原理
目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能 直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板
进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为
PCR反应体系中的主要成分及其作用：
模板DNA：一般102－105个拷贝
Mg2＋：Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。 一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L
反应反冲液 ：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏 碱性。 dNTP ：在 PCR 反应体系中其浓度一般为 20 － 200 mol/L，浓度过高、过低都不利。
防止内源RNA酶降解RNA
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材料要新鲜;
裂解过程要同RNase活性抑制同步
RNA酶抑制剂
RNA酶是一种强有力的酶，在RNA
分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的
完整性。用来使RNA酶不发挥作用的
RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC(Diethyl-pyrocarbonate) 或 DMDC(Dimethyl-dicarbonate) 2. 氧钒核糖核苷复合物 3. RNA酶的蛋白质抑制剂
AFP基因表达检测
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
甲 胎 蛋 白 序 列
DNA
实验原理
mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板
进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交
更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便， 它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方 法。
DEPC:
是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧 基甲酸化形式破坏RNase的活性
氧钒核糖核苷复合物:
能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百 地抑制RNA酶的活性
RNA酶蛋白质抑制剂 Ribonuclease Inhibitor
可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。 不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。
取样后没有立即抽提RNA；
抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70 ℃ ，而不是-20 ℃ ） 使用的溶液或器皿有RNase污染 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5
RNA污染的原因
样品太多，所加试剂相对太少
用来分离RNA的样品中含有机溶剂 （乙醇，DMSO等），或碱溶液等
变性
在 P CR 管中 分别加 入 : 去离子 水 10 μ l , 2 . 5 mMdN TP 4 μ l , A FP 上游引物 2 0 p mol , A FP 下引物 20 pmol ,β - ac ti n 上游引物 20 p mol , β - a c ti n 下游引物 20 p mol , c D N A 7 μ l 。95 ℃ 预变性 5 分钟 , 迅速放于 冰浴中 。
防止外源RNase污染的主要措施： 5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻 璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品 使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话， 用0.1％的DEPC在37º C处理溶液1小时后在 15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。 6. 180－300º C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活 RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 7. 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 8. 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶 的活性。
2. . P M NCs 的总 R NA 的提取
用 Tr iz ol R N A 提取液( GI BCO BRL ) , 以改良的异硫 氰酸胍 - 酚 - 氛仿一步法提取总 R AN , 放 - 80 ℃ 保存 。
并抽提 Hep G2 细胞株的总 R N A , 放 - 80 ℃ 保存
RNA降解的主要原因
根据引物及基因的表达水平设置循环参数： 如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及 mRNA 的丰度等
对照实验 同时以 Hep G2 总 RN A 作为阳性对照 、 水 作为阴性对照进行扩增 , 排除假阳性和假阴 性的情况 。 阳性对照组：用倍比稀释法将不同数 量的 Hep G2 细胞加入到10 ml 正常人外周血中 ( 白细胞 107/ml) , 再提取 P MN Cs的总 R N A 并行 RT - PCR
4. DNA 溶液中或反应体系中含有 Taq 酶抑制剂，抑制了 Taq DNA聚合酶的活性。
5. 退火温度太高；
6. Taq 酶活力不够或其他试剂有问题； 7. 引物设计不合理，与模板不配对等。
RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量 要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时 空表达的常用方法。
PCR技术
PCR（多聚酶链式反应〕是一种体外扩增特异 DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术 之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖 于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决 于引物和模板结合的特异性。反应分为变性 （denaturation，）退火（annealing）、延伸 （extension）三步，经过一定的循环，介于两个引 物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
反转录
取 1 μ g 总 R NA 加入随机引物 0 . 5 μ g , 70 ℃ 温浴 5分钟 , 迅速放置冰浴中 , 再加入 2 . 5 m M d NTP 4 μ l , R N A酶抑 制 剂 25u , 5 xR T 缓 冲 液 5μ l , M M L V 逆 转 录 酶( Pr o me ga ) 200u , 加 D EP C 处 理 水至总体积 25μ l 。 37 ℃温浴 1 小时 , 迅速放于冰中 , - 80 ℃ 冰箱 保存 。
PCR扩增产物电泳检测
PCR产物的电泳检测时出现拖带或非 特异性扩增带的可能原因：
1. Taq酶过多； 2. Mg2+浓度不合适；
3. 引物浓度过高或设计不合理；
4. 复性温度过低； 5. 循环次数过多； 6. 模板量过多；
引物问题
引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；产生 引物二聚体 引物长度：一般18－28 bp；GC含量约50－60％ 配对引物的Tm值要相当 引物3’端应尽量避免互补，以免产生引物二聚体 引物3’端3个或3个以上的GC，容易结合到基因组 GC丰富区域，导致错误扩增