精氨酸激酶(AK)的提取与纯化 2010114020208 朱景鹏

精氨酸激酶（AK）的提取与纯化

生物学实验教学中心

目录

１引言 (1)

1.1精氨酸激酶（AK） (1)

1.2亲和层析法 (2)

1.3电泳法 (2)

1.4本实验主要工作 (3)

2.1实验用品 (3)

2.1.1实验材料 (3)

2.1.1实验试剂 (3)

2.1.2仪器设备 (4)

2.2方法 (5)

2.2.1活化菌种 (5)

2.2.2 扩大培养 (5)

2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)

2.2.4 蛋白质提取 (5)

2.2.5蛋白质的检测 (6)

2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)

3 结果与分析 (7)

3.1蛋白质层析图谱 (7)

3.2AK诱导表达电泳图 (8)

4总结 (9)

参考文献 (10)

致谢 (10)

精氨酸激酶（AK）的提取与纯化

朱景鹏

（指导老师：汪劲松）

（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）

摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。

关键词：精氨酸激酶分离与纯化

１引言

1.1精氨酸激酶（AK）

精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。它的作用是催化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子——磷酸精氨酸[3]，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2+ + ATP + Arginine AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。

虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基

AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。

2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。

3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。

1.2亲和层析法

依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。

当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。

His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni 离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。

1.3电泳法

电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）,其作用是用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶

（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。

1.4本实验主要工作

1.4.1 从大肠杆菌Rosseta中得到精氨酸激酶的粗提液

1.4.2 对精氨酸激酶粗提液通过Ni亲和层析进行进一步纯化

1.4.3 对所得结果通过SDS-PAGE进行检测

2材料与方法

2.1实验用品

2.1.1材料

含有重组有AK基因质粒的表达菌体E. coli Rosetta

2.1.2试剂

LB液体培养基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g

50 mg/mL 卡那霉素（kanamycin）

IPTG

Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0

咪唑（10 mM、250 mM）