第二章基因工程制药详解
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酵母
优点：
遗传背景清楚 世代时间短，繁殖迅速，可廉价的大规模培养，无毒性 基因操作简单 可将表达产物直接分泌到胞外，可简化产物分离纯化工
艺 能对产物进行糖基化修饰 能很好的表达在细菌系统中表达不良的真核基因
丝状真菌
优点：
有很强的蛋白分泌能力 能正确进行翻译后加工，包括肽的剪切和糖基化修饰，
不能对蛋白质进行糖基化修饰 会产生很强的胞外蛋白酶，可对产物进行不同程度的降
解
链霉菌
优点：
非致病，使用安全 分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中 具有糖基化修饰能力 变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可作为理想的受体菌 已构建一系列有效的载体 下游培养工艺成熟
具有高浓度、高产量、高产率 能利用廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低，需氧低，适当温度和细胞形态 容易进行代谢调控 容易进行重组DNA技术 产物容易提取纯化
2.4.2 宿主分类
原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉 菌
真核细胞：酵母、丝状真菌
大肠杆菌
优点：研究较为深入
对已发现基因改造
基因修饰技术 定点突变技术 目的：提高基因表达产物的稳定性，提高体
内半衰期、提高表达产物生物学活性、降低 有效使用剂量或提高表达量、降低毒性和免 疫原性
2.4 基因表达
目的基因表达产量 表达产物稳定性 产物生物学活性 表达产物分离纯化
2.4.1 宿主应满足条件
措施2：宿主细胞的生长与质粒的复制分开
措施3：表达产物形成不溶于水的包涵体可 降低对宿主的毒性
真核基因在大肠杆菌中表达的形式
融合蛋白
优点：蛋白质在菌体内稳定，不易被降解，易实现高效表达 缺点：融合蛋白只能作为抗原，所以会影响蛋白的免疫原性，一般不能作
为人体注射用药
非融合蛋白
第二章 基因工程制药
2.1 概述
1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在 美国问世，吸引和激励科学家利用基因工程 技术研制新产品。
迄今，30余种基因工程药物投入市场，产生 巨大经济和社会效益。
生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗 已经成为现实。
2.1.1 利用基因工程技术生产内源生理 活性物质
糖尿病：胰岛素 侏儒症：人生长激素 其它内源性生理活性物质：激素、细胞因子、神经
多肽、调节蛋白、酶类及凝血因子等 来源困难 技术尚未解决 造价高
利用基因工程技术获得上述活性物质成为可能
2.1.2 基因工程药物种类
免疫球蛋白：抗原和单克隆抗体
细胞因子：干扰素、白细胞介素、集落刺激 因子、表皮生长因子、凝血因子
2.2 基因工程药物生产过程
上游技术：目的基因分离、工程菌（细胞）
构建
在实验室完成
下游阶段：工程菌（细胞）大规模培养直到 产品分离纯化和质量控制等。
2.3 目的基因获得
反转录法
反转录-PCR法
化学合成法
筛选新基因方法：编码序列富集法、岛屿获 救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建 cDNA文库、差异显示技术等
可生产更多的内源性生理活性物质 对内源性生理活性物质使用中出现的问题可以通过
基因工程进行改造 可获得新型化合物，扩大药物筛选范围
2.1.4我国基因工程药物研发现状
1997年生产得到α1b干扰素 上游技术落后3－5年 下游技术（工程菌大规模发酵技术、新型生
物反应器研制、高效分离介质及装置的开发、 分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技 术、生物传感器等）落后15年
缺点：
不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取时需将细胞破 碎，造成提取困难
分泌能力不足，真核蛋白常形成包涵体，表达产物须经 变性复性才能恢复其生物学活性
不存在翻译后修饰，只能适用于表达糖基化等
枯草芽孢杆菌
优点：
分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中 不形成包涵体
缺点：
采用蛋白酶缺陷型菌株，减弱表达产物的降 解
细胞代谢负荷
外源基因表达产物为异己物质，对宿主菌有 毒性，甚至使宿主细胞死亡
大量的外源基因表达产物能打破宿主细胞生 长平衡，影响其它代谢过程，影响宿主细胞 生长和代谢，而细胞代谢损伤又抑制外源产 物合成
如何减轻细胞代谢负荷
措施1：细胞大量生长时抑制外源基因表达
别 应具有阻遏子，使启动子受调控，只有诱导时才能
转录 应具有强的终止子，以便于转录克隆的外源基因，
而不转录其它无关基因 所产生的mRNA应具有翻译起始信号，以便转录后
能顺利翻译
影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
外源基因剂量 外源基因表达效率
启动子强弱 核糖体结合位点的有效性 SD序列和起始密码子的间距 密码子组成
外源产物的稳定性 细胞的代谢负荷 工程菌的培养条件
如何提高表达产物的稳定性
组建融合基因，产生融合蛋白 利用大肠杆菌的信号肽或真核蛋白自身的信
号肽，以确保真核基因表达产物分泌到胞浆 （外源蛋白不易为细菌酶类所降解）中
采用位点特异性突变，改变真核蛋白质中二 硫键的位置，从而增加稳定性
激素：胰岛素、生长激素、心钠素
酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤 维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶
2.1.3 利用基因工程生产药品优点
可大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽， 为临床使用提供有效的保证
可提供足够数量的生理活性物质，便于对其生理、 生化和结构进行深入研究，扩大这些物质的应用范 围
而且糖基化修饰与高等真核生物相似 安全，有成熟的发酵和后处理工艺
当前研究重点
加强对宿主菌遗传背景的研究 建立合适的克隆载体和DNA导入方法 研究清楚影响基因表达的各种因素及相互关系 寻找新的适于不同外源基因表达的宿主菌
2.4.3 大肠杆菌表达载体的要求
载体能独立复制 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 具有很强的启动子，且能为大肠杆菌RNA聚合酶识
优点：能较好的保持蛋白原有活性 缺点：易被蛋白酶破坏，且非融合蛋白氨基端通常带有甲硫氨酸，在体内
酵母
优点：
遗传背景清楚 世代时间短，繁殖迅速，可廉价的大规模培养，无毒性 基因操作简单 可将表达产物直接分泌到胞外，可简化产物分离纯化工
艺 能对产物进行糖基化修饰 能很好的表达在细菌系统中表达不良的真核基因
丝状真菌
优点：
有很强的蛋白分泌能力 能正确进行翻译后加工，包括肽的剪切和糖基化修饰，
不能对蛋白质进行糖基化修饰 会产生很强的胞外蛋白酶，可对产物进行不同程度的降
解
链霉菌
优点：
非致病，使用安全 分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中 具有糖基化修饰能力 变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可作为理想的受体菌 已构建一系列有效的载体 下游培养工艺成熟
具有高浓度、高产量、高产率 能利用廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低，需氧低，适当温度和细胞形态 容易进行代谢调控 容易进行重组DNA技术 产物容易提取纯化
2.4.2 宿主分类
原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉 菌
真核细胞：酵母、丝状真菌
大肠杆菌
优点：研究较为深入
对已发现基因改造
基因修饰技术 定点突变技术 目的：提高基因表达产物的稳定性，提高体
内半衰期、提高表达产物生物学活性、降低 有效使用剂量或提高表达量、降低毒性和免 疫原性
2.4 基因表达
目的基因表达产量 表达产物稳定性 产物生物学活性 表达产物分离纯化
2.4.1 宿主应满足条件
措施2：宿主细胞的生长与质粒的复制分开
措施3：表达产物形成不溶于水的包涵体可 降低对宿主的毒性
真核基因在大肠杆菌中表达的形式
融合蛋白
优点：蛋白质在菌体内稳定，不易被降解，易实现高效表达 缺点：融合蛋白只能作为抗原，所以会影响蛋白的免疫原性，一般不能作
为人体注射用药
非融合蛋白
第二章 基因工程制药
2.1 概述
1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在 美国问世，吸引和激励科学家利用基因工程 技术研制新产品。
迄今，30余种基因工程药物投入市场，产生 巨大经济和社会效益。
生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗 已经成为现实。
2.1.1 利用基因工程技术生产内源生理 活性物质
糖尿病：胰岛素 侏儒症：人生长激素 其它内源性生理活性物质：激素、细胞因子、神经
多肽、调节蛋白、酶类及凝血因子等 来源困难 技术尚未解决 造价高
利用基因工程技术获得上述活性物质成为可能
2.1.2 基因工程药物种类
免疫球蛋白：抗原和单克隆抗体
细胞因子：干扰素、白细胞介素、集落刺激 因子、表皮生长因子、凝血因子
2.2 基因工程药物生产过程
上游技术：目的基因分离、工程菌（细胞）
构建
在实验室完成
下游阶段：工程菌（细胞）大规模培养直到 产品分离纯化和质量控制等。
2.3 目的基因获得
反转录法
反转录-PCR法
化学合成法
筛选新基因方法：编码序列富集法、岛屿获 救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建 cDNA文库、差异显示技术等
可生产更多的内源性生理活性物质 对内源性生理活性物质使用中出现的问题可以通过
基因工程进行改造 可获得新型化合物，扩大药物筛选范围
2.1.4我国基因工程药物研发现状
1997年生产得到α1b干扰素 上游技术落后3－5年 下游技术（工程菌大规模发酵技术、新型生
物反应器研制、高效分离介质及装置的开发、 分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技 术、生物传感器等）落后15年
缺点：
不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取时需将细胞破 碎，造成提取困难
分泌能力不足，真核蛋白常形成包涵体，表达产物须经 变性复性才能恢复其生物学活性
不存在翻译后修饰，只能适用于表达糖基化等
枯草芽孢杆菌
优点：
分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中 不形成包涵体
缺点：
采用蛋白酶缺陷型菌株，减弱表达产物的降 解
细胞代谢负荷
外源基因表达产物为异己物质，对宿主菌有 毒性，甚至使宿主细胞死亡
大量的外源基因表达产物能打破宿主细胞生 长平衡，影响其它代谢过程，影响宿主细胞 生长和代谢，而细胞代谢损伤又抑制外源产 物合成
如何减轻细胞代谢负荷
措施1：细胞大量生长时抑制外源基因表达
别 应具有阻遏子，使启动子受调控，只有诱导时才能
转录 应具有强的终止子，以便于转录克隆的外源基因，
而不转录其它无关基因 所产生的mRNA应具有翻译起始信号，以便转录后
能顺利翻译
影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
外源基因剂量 外源基因表达效率
启动子强弱 核糖体结合位点的有效性 SD序列和起始密码子的间距 密码子组成
外源产物的稳定性 细胞的代谢负荷 工程菌的培养条件
如何提高表达产物的稳定性
组建融合基因，产生融合蛋白 利用大肠杆菌的信号肽或真核蛋白自身的信
号肽，以确保真核基因表达产物分泌到胞浆 （外源蛋白不易为细菌酶类所降解）中
采用位点特异性突变，改变真核蛋白质中二 硫键的位置，从而增加稳定性
激素：胰岛素、生长激素、心钠素
酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤 维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶
2.1.3 利用基因工程生产药品优点
可大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽， 为临床使用提供有效的保证
可提供足够数量的生理活性物质，便于对其生理、 生化和结构进行深入研究，扩大这些物质的应用范 围
而且糖基化修饰与高等真核生物相似 安全，有成熟的发酵和后处理工艺
当前研究重点
加强对宿主菌遗传背景的研究 建立合适的克隆载体和DNA导入方法 研究清楚影响基因表达的各种因素及相互关系 寻找新的适于不同外源基因表达的宿主菌
2.4.3 大肠杆菌表达载体的要求
载体能独立复制 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 具有很强的启动子，且能为大肠杆菌RNA聚合酶识
优点：能较好的保持蛋白原有活性 缺点：易被蛋白酶破坏，且非融合蛋白氨基端通常带有甲硫氨酸，在体内