人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RP HPLC测定法

人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的

RP-HPLC测定法

（作者：________ 单位：____________ 邮编： ___________ ）

【摘要】目的：建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric Dimethylarginine ，ADMA浓度的反相高效液相色谱法（RP-HPLC。方法：采用Waters symmetry C18柱（5卩m 3.90 mm X 150 mm,以0.05 mmol/L乙酸钠（pH6.8）为流动相A,甲醇为流动相B,线性梯度洗脱：14%15 min, 31%25 min, 45%5 min （V/V/V）, 流速1.0 ml/min，荧光检测，激发波长330 nm,发射波长450 nm, 邻苯二甲醛（OPA进行柱前衍生，室温下检测。结果:ADMA在0.05〜5卩g/ml范围内有良好线性关系，最小检出量为0.05卩g/ml ,平均相对回收率为（93.76 士 2.57 ）%日内、日间平均变异系数分别为（3.25 士

1.59）%、（4.60 士1.37）%。结论:本方法准确、简便、快速，适用于

科学研究和临床检测。

【关键词】非对称性二甲基精氨酸色谱法反相高效液相

血浆中非对称性二甲基精氨酸（Asymmetrical dimethylargi nine , ADMA浓度变化与心血管疾病发生发展密切相关，近年来研究显示

ADMA升高是一种新的心血管病危险因素［1］。关于血浆中ADMA浓度的检测方法，国外虽已有报道［2，3］，但操作繁琐，干扰因素多。国内曾有采用正相色谱法的报道［4］。本研究在国内外同类研究的基础上适当改进，采用反相色谱法，用一元线性梯度洗脱，建立一套准确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中ADMA浓度的方法，报告

如下。

1材料

1.1试剂AMDA标准品、衍生剂OPA3-巯基丙酸均购自Sigma公司，HPLC分析纯度99.99%;甲醇为一级色谱纯，购自天津市四友生物医药科技有限公司；硼酸为一级色谱纯，购自上海试剂总厂；乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯，购自上海试剂总厂。超纯水（18.25 M cm）。

1.2仪器与设备高效液相色谱仪为Agilent11OO系列，包括G1322 在线脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1321A FLD荧光检测器；自动进样器；Agile nt化学工作站（RevA.08.03.［847］）。高速离心机（TGL-16G上海安亭科学仪器厂出品）；漩涡混合器（XW-80A, 上海医科大学仪器厂生产）；电子分析天平（AB204-A上海梅特勒- 托利多仪器公司灵敏度0.1 mg）；超纯水制备机（杭州永洁达净化科技有限公司生产）。

1.3 AMDA工作液配制准确称取ADMA标准品10 mg于100 ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得浓度为100卩g/ml ADMA储备液。再用超

纯水依次稀释为1卩g/ml、2卩g/ml、4卩g/ml、8卩g/ml、10卩

g/ml、20卩g/ml、40卩g/ml的ADM工作液，贮存于4 C备用。

1.4流动相A配制精密称取乙酸钠4.1 g,用重蒸水溶解后，在1000 ml容量瓶中定容，用2 mol/L冰乙酸调节pH值到6.8，即得浓度为0.05卩mol/L，pH6.8的乙酸钠溶液，然后用0.45卩m滤膜过滤，超声脱气。

1.5 OPA衍生剂配制精确称取OPA 20 mg力口400卩l的甲醇，0.2 mol/L硼酸3.6 ml （pH=9.5），3-巯基丙酸20卩l，混匀避光（现配，现用）。

2方法和结果

2.1 色谱条件色谱柱：Waters Symmetry C18 柱（5卩m

3.9 mm x 150 mn），保护柱：Waters Symmetry C18 保护柱（5卩m 3.9 mm x 20 mm；流动相：A为0.05卩mmol/L乙酸钠（pH6.8），B为甲醇，按B 14% 15 min，31% 25 min，45% 5 min （V/V/V）梯度洗脱；进样量20卩l ;流速1.0 ml/min ;柱温40 C；荧光检测波长：激发波长330 nm,发射波长450 nm。

2.2 血浆样品处理方法于1.5 ml离心管（EP管）中精密

加入待测血浆1.0 ml，加入20 mg 5-磺基水杨酸，漩涡混匀5 min，冰浴15 min，于12000 r/min 离心10 min，吸取上清液。

2.3样本柱前衍生取“ 2.1 ”中上清液100卩l，加OPA衍生剂100 卩l，漩涡混匀避光2 min后，上机，自动进样检测，色谱图见图1, 可见血浆中ADMAI形良好，分离完全，无杂质峰干扰。

2.4标准曲线的制备于7支1.5 ml离心管中依次加入不同量的不同浓度的AMD工作液，再各加入人空白血浆，配成终浓度依次为0.05

a g/ml、0.1 卩g/ml、0.2 卩g/ml、0.5 卩g/ml、1.0 卩g/ml、2.0 卩

g/ml、

5.0 a g/ml的血浆标准品溶液系列。再按血浆样本处理方法处理后分别测定，并记录色谱图，以峰面积为纵坐标，ADMA浓度为横坐标

进行线性回归，得直线回归方程Area=60.90027848 x Amt+3.5852958, r=0.99973，最小检出量0.05 a g/ml，其含量在0.05〜5.0 a g/ml之间有良好的线性关系。

2.5精密度试验按“2.3 ”项分别配制浓度为0.1 a g/ml、0.2 a g/ml、0.5 a g/ml的血浆标准品溶液。按血浆样本处理方法处理后，日内衍生5次，隔日再衍生5次，分别计算日内变异和日间变异。结果见表

1。

2.6回收率试验（相对回收率）按“ 2.3 ”项分别配制浓度为0.1

a g/ml、0.2 a g/ml、0.5 a g/ml的血浆标准品溶液。再按血浆样本处理方法处理后测其浓度，以实测浓度与配制浓度之比乘以100%十算ADMA勺相对回收率，重复试验5次。结果见表2。

3讨论

本研究方法在国内外同类研究的基础上进行了适当改进，采用线性梯度洗脱。线性梯度洗脱能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度等。本研究中ADMAB峰干净，形态良好、对称，但出峰时间较