甾体皂苷提取分离及结构研究方法_王莹莹

甾体皂苷提取分离及结构研究方法

王莹莹，寇永奎，朱建松

（华中师范大学生命科学学院，武汉４３００７９）

摘要：甾体皂苷是一类重要的生物活性物质，是许多药用植物的有效成分之一，随着人们对甾体皂

苷生理活性的研究，如何从天然产物中提取分离甾体皂苷及其结构研究引起人们的广泛关注。本文就甾体皂苷的提取分离及结构研究方法作一综述，为进一步开发利用甾体皂苷药用植物资源提供参考。

关键词：甾体皂苷；提取；分离；化学结构基金项目：国家８６３计划项目（２００４ＡＡ２Ｚ３５５０）

作者简介：王莹莹（１９８０－），女，山东临沂人，华中师范大学生命科学学院２００４级硕士研究生，研究方向为植物化学与药物工程。

甾体皂苷（ｓｔｅｒｏｉｄａｌｓａｐｏｎｉｎｓ）是一类由螺甾烷类（ｓｐｉｒｏｓｔａｎｅｓ）化合物衍生的寡糖苷，其皂苷元是由２７个碳原子组成。植物中的甾体皂苷以百合科、薯蓣科、蒺藜科、茄科研究报道最多，在如玄参科、石蒜科、豆科、鼠李科的一些植物中也含有甾体皂苷。常用中药知母、麦冬、七叶一枝花等都含有大量的甾体皂苷［１］。近年来，人们从如海参［２］、软珊瑚Ｃａｒｉｊｏａｒｉｉｓｅｉ［３］等海洋生物中分离到多种具有生理活性的甾体皂苷。甾体皂苷除因作为合成甾体激素和避孕药的原料而著名外，其自身的药用价值也引起人们的关注。某些皂苷具有抗肿瘤［４］、抗真菌［５］、防治心脑血管疾病［６］、降血糖［７］、杀灭钉螺［８］等活性。为了更好地开发天然甾体皂苷药物，本文就甾体皂苷的提取分离及结构研究方法作一简要综述。

１提取方法

甾体皂苷类化合物由于连有糖残基，一般有较强的极性，易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，不易溶于氯仿、乙醚等非极性溶剂。目前，实验室最常用不同浓度的工业乙醇或甲醇提取。也有用水作为溶剂的，如：

Ｊｉａｎｙｉｎｇｚｈａｎｇ等用８０－８５℃的水从Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ的根状茎中提取到六种甾体皂苷［９］。也

可以先用氯仿、石油醚等强亲脂性溶剂处理中草药原料，然后用乙醇为溶剂加热提取，冷却提取液，多数甾体皂苷由于难溶于冷乙醇而作为沉淀析出［１０］。

２除杂方法

无论是用水还是醇作为溶剂提取所得到的皂苷，多还包含许多杂质，如无机盐、糖类、鞣质、色素等，尚需要进一步精制。

２．１液液萃取法

这是一种最普遍的皂苷除杂方法，利用皂苷一般极性较大，易溶于水而其中的一些杂质极性较小易溶于非极性溶剂的性质来去除一些脂溶性的杂质。一般的操作是将醇提取液减压浓缩得到的浸膏，悬浮于水中，依次用石油醚、

乙酸乙酯、正丁醇进行梯度萃取，甾体皂苷一般存在于正丁醇层，减压回收正丁醇后得总皂苷。

２．２沉淀法

在含甾体皂苷的甲醇或乙醇液中倒入大量的乙醚或丙酮，可将皂苷类化合物沉淀出来。进一步利用过滤或离心的方法即得总皂苷，反复利用这种沉淀法可达到初步纯化的效果。

也可利用皂苷会与胆甾醇形成沉淀的特性进行初步纯化。皂苷溶于乙醇，加胆甾醇的乙醇溶液沉淀，过滤，沉淀干燥后置于索氏（ｓｏｘｈｌｅｘ）提取器中用苯回流，不溶物为皂苷，苯液浓缩后可回收胆甾醇。

２．３吉拉德（Ｇｉｒａｒｄ）腙法

吉拉德试剂Ｔ或Ｐ在一定条件下，可与含羰基的

甾体皂苷元生成腙，而与不含羰基的甾体皂苷元分离。通常先将粗甾体皂苷元溶于少量乙醇，再加入吉拉德试剂Ｔ或Ｐ，并加乙酸使达１０％的含量，水浴加热或室温下放置后，加水稀释，加入乙醚萃取除去不含羰基的皂苷元，在水相中加入盐酸使羰基皂苷元形成的吉拉德腙水解，即可得原羰基皂苷元。

２．４大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂多为苯乙烯或２—甲基丙烯酸酯型，理化性质稳定，不溶于水、酸、碱及常用有机溶剂。根据其结构单元不同分为各种型号，常用的如：Ｄ１０１型、ＤＡ－２０１型、ＤｉａｉｏｎＨＰ－２０型、ＡＢ－８型等［１１］。舒孝

华中师范大学研究生学报

ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ

第１４卷第１期

Ｖｏｌ．１４Ｎｏ．１２００７年３月Ｍａｒｃｈ２００７

顺等用大孔树脂分离菝葜总皂苷，从ＨＰＤ１００、ＨＰＤ３００、ＨＰＤ６００、及Ｄ１０１四种大孔树脂中筛选出ＨＰＤ１００非极性树脂，研究结果表明该树脂对于本体系中的总皂苷具有吸附快解吸较易、流体流动性能好、操作简单和周期短等优势［１２］。

在用大孔树脂获得较为精致的总皂苷后，为进一步获得皂苷单体，一般还需采用其他的色谱方法。

３分离方法

甾体皂苷亲水性较强，有些皂苷极性非常接近，以上述方法分离纯化，难以获得单体化合物，所以皂苷经过一定的纯化后，常采用不同的色谱法分离甚至反复经过色谱法分离，才能获得单体成分。

３．１制备薄层层析法

方法与薄层层析相同，只是增加薄层吸附剂厚度来增加其载药量，与柱层析相比，分离效果更好，能用来制备较纯的皂苷，但制备量最大仍只能达到几百毫克。

３．２硅胶柱层析法

硅胶柱层析是一种传统的分离方法，目前在甾体皂苷的分离工作中仍被广泛应用。如：陈梦菁通过多次硅胶柱层析，从四川蜘蛛抱蛋中分离到了三种甾体皂苷［１３］。林厚文等运用反复硅胶柱层析从中药玉竹中分离到了四个甾体皂苷［１４］。分离时经常采用氯仿－甲醇－水三元溶剂体系。在氯仿－甲醇溶剂体系中加入适量的水，可克服皂苷类化合物进行硅胶色谱分离时产生的拖尾现象，获得更好的分离效果。

３．３反向硅胶柱层析法

近年来反向键合相得到广泛应用。使用最多的预填充反向硅胶柱主要有ＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐＲｐ－８（Ｍｅｒｃｋ，６０－８０％甲醇洗脱）和ＬｏｂａｒＲｐ－８（Ｍｅｒｃｋ，６０－８０％甲醇洗脱），常使用的反向多孔聚合物有ＤＩＡＩＯＮＨＰ－２０、ＫｏｇｅｌＢＧ４６００（以不同比例的甲醇和水洗脱）。陈昌祥等从云南大理产的蜘蛛抱蛋根茎甲醇提取物中，先经硅胶柱层析，再经硅胶Ｈ柱层析，洗脱部分经Ｒｐ－８反向柱层析得到两种甾体皂苷［１５］。ＴｏｓｈｉｈｉｒｏＩｎｏｕｅ等从ＤｉｃｈｅｌｏｓｔｅｍｍａＭｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ的块茎中通过ＯＤＳ反向硅胶柱层析和硅胶柱层析得到三种新的甾体皂苷和两种已知的皂苷［１６］。

３．４葡聚糖凝胶色谱法

葡聚糖凝胶是由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂（如含氧氯丙烷）以醚桥的形式互相交联聚合而成的三维空间网状结构。利用凝胶吸水后能形成凝胶粒子，在其交联键的骨架中有许多大小的网眼，使进入凝胶内部的分子和不能进入凝胶内部的分子进行分离。常用的凝胶有ｓｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０、Ｇ－１０、Ｇ－２５等。Ｒｏｂｓｏｎ，Ｒ．Ｂ等从ＳｍｉｌａｘＯｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ的根状茎中应用ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０成功得到三种甾体皂苷［１７］。周小平等由分蘖葱头的乙醇提取物经葡聚糖凝胶和硅胶柱色谱分离得到四个甾体皂苷类化合物［１８］。

３．５高效液相层析法（ＨＰＬＣ）中压液相层析（ＭＰＬＣ）和低压液相层析（ＬＰＬＣ）

采用不同的压力，调整流动相的流速，具有很好的分离效果。ＨＰＬＣ在甾体皂苷的分离工作中应用得最为广泛。ＭｉｔｓｕｅＨａｒａｇｕｃｈｉ用硅胶柱层析、ＭＰＬＣ、ＨＰＬＣ法从Ｃｅｓｔｒｕｍｓｅｎｄｔｅｎｅｒｉａｎｕｍ的叶中得到了五种甾体皂苷［１９］。董梅、吴立军等从黄山药的根茎９５％乙醇提取物通过硅胶柱色谱和ＨＰＬＣ分离得到三个甾体皂苷［２０］。

３．６结晶法ＭａｓａｋｉＩｔａｂａｓｈｉ从Ｆｕｒｃｒａｅａｆｏｅｔｉｄａ的干燥叶片中用结晶法得到了一种具有生物活性的甾体皂苷［２１］。

在实验中，通常是几种分离方法相互结合，最终才能得到纯度较高的甾体皂苷。Ｍｉｍａｋｉ，Ｙ．等从Ｃｏｒｄｙｌｉｎｅｓｔｒｉｃｔａ新鲜叶中依次经过硅胶柱层析、ＤｉａｉｏｎＨＰ－２０、ＯＤＳ硅胶层析、分配型硅胶层析、ＨＰＬＣ和ＴＬＣ，最终得到了三个甾体皂苷［２２］。Ｓａｔｏｕ，ｔａｄａａｋｉ利用硅胶柱层析、ＴＬＣ、ＯＤＳ硅胶柱层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０、ＤｉａｄｉｏｎＨＰ－２０、ＨＰＬＣ从Ｌｉｌｉｕｍｍａｒｔａｑｏｎ的新鲜茎中得到二种新的甾体皂苷［２３］。

４结构研究方法

４．１苷键的裂解

苷键的裂解除可获得苷元的单体及糖的信息外，还可获得次级皂苷。通过进行次级皂苷与原皂苷的比较来确定糖的连接顺序及连接位置是过去皂苷结构研究的重要手段。

４．１．１水解

酸水解是甾体皂苷结构研究中最常用的一种方法。一般是将皂苷溶于ＨＣｌ或Ｈ２ＳＯ４溶液中（如不溶解可以加甲醇、乙醇等溶剂助溶）加热一段时间，减压蒸去有机溶剂，水溶液用有机溶剂萃取出皂苷元或用过滤法收集析出的皂苷元沉淀。除去皂苷元的水溶液用碱中和或阴离子交换树脂中和，然后采用纸色谱、薄层色谱或气相色谱与标准品比较鉴定水解生成的单糖。当含两个以上糖单元时，可通过改变酸的浓度或水解反应的温度和时间得到不同的次级苷，比较原皂苷和各次级苷中所含的糖，可推测出糖链／糖的连接顺序。

二相酸水解（缓和酸水解）是指在酸水解反应液中加入一有机相，如苯、甲苯等，反应过程中苷元一旦生成就转入有机相，从而避免了进一步与酸的接触，避免了苷元的副反应。

碱水解通常是将皂苷在ＮａＯＨ水溶液中加热一段时间，反应进行的情况及反应条件的选择如碱液的