中医药论文：黄芪中黄芪总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究

中医药论文：黄芪中黄芪总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究

中医药论文：

黄芪中黄芪总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究【摘要】目的优选出分离纯化黄芪中黄芪总皂苷的最佳工艺条件。方法采用动态吸附,用超高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量,优选出最佳纯化条件。结果D101树脂对黄芪总皂苷的纯化最优,以2 BV/h吸附速率吸附,5 BV 70%乙醇以3 BV/h的流速进行洗脱效果最佳,黄芪甲苷的精制度为446.28%。结论D101大孔吸附树脂可用于黄芪总皂苷的纯化。

【关键词】黄芪;黄芪总皂苷;大孔树脂

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus

membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1],其主要成分为黄芪总皂苷,具有广泛的药理作用,如强心、抗胃溃疡、对外周神经系统的再生具有双重调节作用、降血压等作用[2-5]。本文以黄芪

甲苷为指标对黄芪中黄芪总皂苷的纯化进行了研究,为以后黄芪的进一步开发做基础。

1 材料与仪器

黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110781200613);黄芪药材(浙江中医药大学中药饮片厂),经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。化学试剂均为分析纯。D201、D101、DM130(天津南开大学化工厂)。赛多利斯分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);RE52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),Waters Acquity TM Ultraperformance LC色谱仪、Acquity TM TUV 检测器;

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100

mm,1.7 μm);流动相:乙

腈-水(35∶65); 漂移温度:50℃;流速:0 2 ml/min;柱温:30℃;氮气压力:45PSI。

2.2 对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量,用甲醇制成浓度为0066

mg/ml的溶液,作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取黄芪粗粉约3 g,精密称定,加甲醇24 ml加热回流2次,每次2 h,过滤合并滤液,减压回收并用甲醇定容至50 ml量瓶中,备用。

2.4 标准曲线的制备取“2.2”项下的对照品溶液,分别进样05、1、1.5、2.0、2.5 μl,以对照品峰面积的常用对数值(Y)为纵坐标、进样量(μg)的常用对数值(X)为横坐标进行线

性回归,得回归方程为Y=39921X16698( r =09997)。结果表明,黄芪甲苷进样量在0

033~0165 μg范围内的对数值与峰面积对数值呈良好线性关系。

2.5 精密度实验取2.2项下的对照品溶液进样,重复测定6次,每次进样3 μl,记录峰面

积,计算得RSD为051%。

2.6 稳定性实验按照“2.3”项下制备样品一份,分别于0 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样,每次进样3 μl,依法测定,记录峰面积。计算得RSD 为

3.14%,表明样品在10 h内稳定。

3 上柱药液的制备

取黄芪粗粉约80 g,精密称定,加甲醇240 ml加热回流2次,每次2 h,过滤,合并滤液,减压回收甲醇并用纯净水定容至50 ml量瓶中,备用。

4 树脂的选择

称取预处理过的树脂各5 g于100 ml锥形瓶中,加入一定量供试品溶液,盖紧瓶塞,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静止放置24 h,过滤,测量滤液中黄芪甲苷含量,计算吸附率。将经静态吸附后的树脂水洗至无Molish反应(吸取1 ml清洗液,加5%α3滴,摇匀。沿试管壁缓缓加入0 5 ml浓硫酸,如在试管与硫酸的交界面处,很快形成紫色环),加70%乙

醇20 ml解吸,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静置24 h后,过滤得解析液,测定其黄芪甲苷含量,计算解析率。

表1

树脂的筛选

树脂型号吸附率(%) 转移率(%)

D201 70 5 62.9

D101 92.8 89.2

DM130 88.3 84.8

表1表明,D101对柴胡皂苷和姜黄素的吸附率与转移率均最高,所以选用D101大孔树脂。

5 动态考察

5.1 动态吸附曲线的考察取DM101树脂20 g(ф18 mm×40 cm)于柱内,精密吸取按上述方法制备的黄芪水溶液上柱,流速为3 BV/h,每20 ml收集为一流分,测量流出液中黄芪甲苷的含量。以流出液体积(ml)为横坐标,黄芪甲苷的量(mg)为纵坐标,分别绘制泄漏曲线,计算树脂吸附容量。树脂吸附量=泄漏点上样体积(ml)×样品浓度(mg/ml) 图1 动态泄露曲线

由图1可知,D101树脂的吸附饱和点为120 ml,即每克D101可吸附黄芪甲苷1.25 mg。

5.2 上柱药液浓度的考察取D101树脂10 g,将上述样品(黄芪甲苷浓度为08 mg/ml)分别加水稀释成浓度为04、02、0 1 mg/ml的上样液,以2 BV/h的流速进行吸附,

水洗,70%乙醇以3 BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定黄芪甲苷的含量。

图2 不同药液浓度对黄芪甲苷纯化的影响

由图2可以得出当含黄芪甲苷为08 mg/ml时,吸附率最高,当浓度更高时容易使柱子

堵塞,故确定药液浓度为08 mg/ml。

5.3 吸附流速的考察取最佳浓度下的黄芪水溶液,控制流速1、2、3、4、5 BV/h进行吸附,水洗,以3 BV/h的70%乙醇5 BV洗脱。收集上样残留液和醇洗脱液,分别测定其黄芪甲苷的含量。

图3 不同吸附流速对黄芪甲苷纯化的影响

由图3可得出,当吸附流速为2BV/h时吸附率最大

5.4 乙醇洗脱浓度的考察分别取5根树脂柱各以2BV/h的吸附流速上药液。用纯净水洗后,分别用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇(分别标为15号)各5 BV,以3 BV/h流速依次进行洗脱,分别收集不同浓度的乙醇洗脱液5份。测定含量。

图4 不同乙醇浓度对黄芪甲苷纯化的影响

由图4可得,4号浓度的乙醇对柴胡甲苷纯化最佳,故选择70%的乙醇洗脱。

5.5 洗脱流速的考察按上述所确定的条件进行吸附,洗脱,控制5 BV 70%的乙醇分别以1、2、3、4、5 BV/h洗脱,收集洗脱液,计算柴胡皂苷和姜黄素的含量。

图5 不同洗脱流速对黄芪甲苷纯化的影响

由图5可得,洗脱流速为1 BV/h和3 BV/h时黄芪甲苷的解析率相当,为提高工作效率选用3 BV/h的流速。

6 重复验证试验

根据上述试验结果,按最佳条件,即取浓度为08 mg/ml的黄芪水溶液以2 BV/h上样,水洗至无Molish反应,5 BV 70%乙醇洗脱,收集洗脱