高效液相色谱法 (7)
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4
不同点:
样品用量 分析时间 装置
LC
1-10g 长 1-20h 间断
HPLC
10-6 - 10-2g 10-几十min 连续、自动化
非仪器
精度低
仪器化
精度高
5
10.1 高效液相色谱法类型 10.2 常用固定相与流动相 10.3 高效液相色谱仪 10.4 高效液相色谱条件选择 10ห้องสมุดไป่ตู้5 应用与实例
15
化学键合相的类型
全多孔硅胶为基体 键合相的表面结构：
单分子键合 Si-O-C， Si-O-Si-C 聚合键合 Si-O-Si-C 结合的化学键类型： Si-O-C、Si-N、Si-C、Si-O-Si-C 极性：非极性、中等极性、极性
16
1)非极性键合相：
表面基团为非极性烃基，C18、C8、
18
2)中等极性键合相
常用的有醚基键合相，既可作正相 又可作反相色谱的固定相，视流动
相的极性而定。
19
3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。
可用作正相色谱的固定相，洗脱剂常 用非极性或弱极性溶剂，加入适量 的极性溶剂，以调节洗脱强度。
极性小的先出峰，极性大的后出峰。
20
正相色谱常用固定相结构 氰 基 -(CH2)3C=N 氨 基 -(CH2)nNH2 (n=3 or 4) 二 醇 -(CH2)3OCH(OH)CH2OH 二甲氨基 -(CH2)3N(CH3)2 二 氨基 -(CH2) 3NH(CH2)2 NH2
6
HPLC特点 三高、两广、一少
高效化、高速化、高灵敏度
分析范围广、流动相选择范围广
样品用量少
色谱柱可反复使用、流出组分易
收集、安全
7
HPLC类型
按实验目的 分析型（ϕ1～6：4.6、2.1 mm） 制备型（ϕ10～500mm） 按分离机制
8
按分离机制
9
HPLC类型
反相键合相色谱法 反相离子抑制色谱法 反相离子对色谱法 手性色谱法 亲和色谱法
常用流动相及其选择
选择流动相：
（1）化学性质稳定。 （2）粘度小。 （3）溶剂的纯度要高。 （4）沸点低（制备型）。 （5）与色谱系统的适应性好。
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液固色谱流动相 选择原则 极性大的试样用极性强的洗脱剂 极性小的试样用极性弱的洗脱剂 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度 (ε0)参数来衡量； 分离复杂试样，采用梯度洗脱。
最常用：水、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、 四氢呋喃等。
主要组成是水，极性和表面张力最高，最 弱的流动相，以此洗脱非极性组分时，表 现出的滞留时间最长。
甲醇和乙腈，是最常用的调节剂。（因为 甲醇和乙腈的紫外切点相对较低，且粘度 较小，及易于提纯。）
23
液固色谱中流动相的选择
(1) 强溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力强的溶 剂，洗脱溶质分子的能力也强。
(2) 弱溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力弱的溶 剂，洗脱溶质分子的能力也弱。
(3) 结合能eo eo值越大，溶剂为强溶剂。常用： 正已烷、异辛烷、氯仿、异丙醇、乙腈等。 (4) eo的特点 线性关系。 溶剂强度与溶剂的体积百分比不成
12
化学键合相的形成
13
性能指标
1）覆盖率 指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅 醇基总数的比例。 覆盖率的大小决定键合相是分配还是吸 附占主导。 （2）含碳量(C%) 表示键合相的键合量，与键合反应及表 面覆盖率有关。 高碳、中碳及低碳型
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特点
机理：吸附&分配
化学键合相色谱法（BPC） 化学键合相的优点： 使用过程不流失，耐溶剂冲洗 化学性质稳定，柱子不娇 热稳定性好 载样量大 适用于梯度洗脱
(5) 含水量的控制 通过有机修饰剂的调节，控制 硅胶的含水量。
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反相色谱流动相
注意：
缓冲离子不能产生沉淀。 B 溶剂的紫外切点必须小于所使用的 检测波长。 C 避免使用卤族离子。 D pH 调节在2~7.5之间。不能超过 7.5，否则硅胶将被溶解！
A
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反相色谱的流动相
甲基、苯基等，用作反相色谱的固 定相。 最常用的非极性键合相是十八烷基 键合相（ODS键合相），洗脱剂多 为强极性溶剂，如水、醇、乙腈或 无机盐缓冲液。 常用CH3OH—H2O作流动相，极性 大先出峰，极性小后出峰。
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反相色谱常用的微粒键合相 官能团 载 体 颗粒直径 十八烷基 Zorbax 3~10 um 辛 烷 基 Nucleosil 100A 3~10 um 苯 基 m porasil ~7 um 二甲硅烷 Lichrosorb 3~10 um
HPLC法以经典LC为基础，引入GC 的理论与技术，并加以改进而发展起来 的一种分离分析方法。 是色谱法的一个重要分支，以液体 为流动相，用高压输液系统，将流动相 泵入色谱柱，在柱内各成分被分离后， 进入检测器进行检测，从而实现对试样 的分析。
1
【示例10-1】
现行《中国药典》二部阿司匹林片剂的含量 测定。 色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂； 以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70） 为流动相；检测波长为276 nm。 取片剂20片用1%冰醋酸-甲醇溶液精密制成 100 mL，精密配制阿司匹林0.l g/L对照品溶 液，分别精密取供试品与对照品溶液10 μL， 进行测定。 按外标法以峰面积计算，即得。
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液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
（1)无定形全多孔硅胶 ： YWG ( 2)球形全多孔硅胶：YQG (3）堆积硅珠：YQG 高分子多孔微球：YSG
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化学键合相色谱固定相
将固定液的官能团键合在载体的表面 而构成化学键合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为 化学键合相色谱法(BPC)，简称键 合相色谱法。
2
HPLC与经典LC的比较
相同点：均有四种色谱机理
液固吸附色谱
(HPLSC)
液液分配色谱
离子交换色谱
(HPLLC)
(HPIEC)
凝胶色谱
(HPGPC)
3
不同点: LC
固定相
HPLC
全多孔 表面多孔型的 无定型 全多孔微粒 粒度 不均匀不耐高压 均匀耐高压 操作压力 常压、低压 高压 柱效 10-100/m 104 -106 /m 柱长 1-2m 10-25cm 柱内径 2-5cm 0.2- 0.5cm
不同点:
样品用量 分析时间 装置
LC
1-10g 长 1-20h 间断
HPLC
10-6 - 10-2g 10-几十min 连续、自动化
非仪器
精度低
仪器化
精度高
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10.1 高效液相色谱法类型 10.2 常用固定相与流动相 10.3 高效液相色谱仪 10.4 高效液相色谱条件选择 10ห้องสมุดไป่ตู้5 应用与实例
15
化学键合相的类型
全多孔硅胶为基体 键合相的表面结构：
单分子键合 Si-O-C， Si-O-Si-C 聚合键合 Si-O-Si-C 结合的化学键类型： Si-O-C、Si-N、Si-C、Si-O-Si-C 极性：非极性、中等极性、极性
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1)非极性键合相：
表面基团为非极性烃基，C18、C8、
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2)中等极性键合相
常用的有醚基键合相，既可作正相 又可作反相色谱的固定相，视流动
相的极性而定。
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3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。
可用作正相色谱的固定相，洗脱剂常 用非极性或弱极性溶剂，加入适量 的极性溶剂，以调节洗脱强度。
极性小的先出峰，极性大的后出峰。
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正相色谱常用固定相结构 氰 基 -(CH2)3C=N 氨 基 -(CH2)nNH2 (n=3 or 4) 二 醇 -(CH2)3OCH(OH)CH2OH 二甲氨基 -(CH2)3N(CH3)2 二 氨基 -(CH2) 3NH(CH2)2 NH2
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HPLC特点 三高、两广、一少
高效化、高速化、高灵敏度
分析范围广、流动相选择范围广
样品用量少
色谱柱可反复使用、流出组分易
收集、安全
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HPLC类型
按实验目的 分析型（ϕ1～6：4.6、2.1 mm） 制备型（ϕ10～500mm） 按分离机制
8
按分离机制
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HPLC类型
反相键合相色谱法 反相离子抑制色谱法 反相离子对色谱法 手性色谱法 亲和色谱法
常用流动相及其选择
选择流动相：
（1）化学性质稳定。 （2）粘度小。 （3）溶剂的纯度要高。 （4）沸点低（制备型）。 （5）与色谱系统的适应性好。
22
液固色谱流动相 选择原则 极性大的试样用极性强的洗脱剂 极性小的试样用极性弱的洗脱剂 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度 (ε0)参数来衡量； 分离复杂试样，采用梯度洗脱。
最常用：水、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、 四氢呋喃等。
主要组成是水，极性和表面张力最高，最 弱的流动相，以此洗脱非极性组分时，表 现出的滞留时间最长。
甲醇和乙腈，是最常用的调节剂。（因为 甲醇和乙腈的紫外切点相对较低，且粘度 较小，及易于提纯。）
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液固色谱中流动相的选择
(1) 强溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力强的溶 剂，洗脱溶质分子的能力也强。
(2) 弱溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力弱的溶 剂，洗脱溶质分子的能力也弱。
(3) 结合能eo eo值越大，溶剂为强溶剂。常用： 正已烷、异辛烷、氯仿、异丙醇、乙腈等。 (4) eo的特点 线性关系。 溶剂强度与溶剂的体积百分比不成
12
化学键合相的形成
13
性能指标
1）覆盖率 指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅 醇基总数的比例。 覆盖率的大小决定键合相是分配还是吸 附占主导。 （2）含碳量(C%) 表示键合相的键合量，与键合反应及表 面覆盖率有关。 高碳、中碳及低碳型
14
特点
机理：吸附&分配
化学键合相色谱法（BPC） 化学键合相的优点： 使用过程不流失，耐溶剂冲洗 化学性质稳定，柱子不娇 热稳定性好 载样量大 适用于梯度洗脱
(5) 含水量的控制 通过有机修饰剂的调节，控制 硅胶的含水量。
24
反相色谱流动相
注意：
缓冲离子不能产生沉淀。 B 溶剂的紫外切点必须小于所使用的 检测波长。 C 避免使用卤族离子。 D pH 调节在2~7.5之间。不能超过 7.5，否则硅胶将被溶解！
A
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反相色谱的流动相
甲基、苯基等，用作反相色谱的固 定相。 最常用的非极性键合相是十八烷基 键合相（ODS键合相），洗脱剂多 为强极性溶剂，如水、醇、乙腈或 无机盐缓冲液。 常用CH3OH—H2O作流动相，极性 大先出峰，极性小后出峰。
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反相色谱常用的微粒键合相 官能团 载 体 颗粒直径 十八烷基 Zorbax 3~10 um 辛 烷 基 Nucleosil 100A 3~10 um 苯 基 m porasil ~7 um 二甲硅烷 Lichrosorb 3~10 um
HPLC法以经典LC为基础，引入GC 的理论与技术，并加以改进而发展起来 的一种分离分析方法。 是色谱法的一个重要分支，以液体 为流动相，用高压输液系统，将流动相 泵入色谱柱，在柱内各成分被分离后， 进入检测器进行检测，从而实现对试样 的分析。
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【示例10-1】
现行《中国药典》二部阿司匹林片剂的含量 测定。 色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂； 以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70） 为流动相；检测波长为276 nm。 取片剂20片用1%冰醋酸-甲醇溶液精密制成 100 mL，精密配制阿司匹林0.l g/L对照品溶 液，分别精密取供试品与对照品溶液10 μL， 进行测定。 按外标法以峰面积计算，即得。
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液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
（1)无定形全多孔硅胶 ： YWG ( 2)球形全多孔硅胶：YQG (3）堆积硅珠：YQG 高分子多孔微球：YSG
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化学键合相色谱固定相
将固定液的官能团键合在载体的表面 而构成化学键合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为 化学键合相色谱法(BPC)，简称键 合相色谱法。
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HPLC与经典LC的比较
相同点：均有四种色谱机理
液固吸附色谱
(HPLSC)
液液分配色谱
离子交换色谱
(HPLLC)
(HPIEC)
凝胶色谱
(HPGPC)
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不同点: LC
固定相
HPLC
全多孔 表面多孔型的 无定型 全多孔微粒 粒度 不均匀不耐高压 均匀耐高压 操作压力 常压、低压 高压 柱效 10-100/m 104 -106 /m 柱长 1-2m 10-25cm 柱内径 2-5cm 0.2- 0.5cm