Ch目的基因的获取

（1）衔接物（Linker）
含有某种酶切位点的短双链DNA（8～14 bp）
EcoRI linker （2）接头（Adaptor）
GAATTC CTTAAG
含有某种酶切位点的粘性末端的短双链DNA
（8～14 bp，如linker的酶切产物）
EcoRI adaptor
AATTC G
G CTTAAG
第三节 目的基因的保存和扩增
A组织 总mRNA(A) 总cDNA(A)第一链
B组织 总mRNA(B)
A特异性cDNA第一链 AB共有的cDNA第一链 B特异性mRNA AB共有的mRNA
过HAP柱 收集cDNA单链
3. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）
（differential di3s′plAaGy RTTT-TPTCTRT）TT 5′
反转录酶
2. cDNA library
把某种生物的总mRNA反转录成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行 扩增形成的所有菌落称cDNA文库
3. cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列 （2）可以在细菌中直接表达 （3）包含了所有编码蛋白质的序列 （4）比DNA文库小的多，容易构建 （5）组织特异性
第三章 目的基因的获取
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第一节 基因组DNA片断化
一、限制性内切酶法
用限制性内切酶把目的基因片段从基因组DNA 中切出来
限制酶 Southern blotting
1. 优点 带有粘性末端，产物可以直接与载体连接
2. 缺点 往往带有不需要的DNA片段 目的基因也可能被内切酶切断
OH
R1HO5′ O
4′
1′
3′ 2′
O
R2- O-P=O
O-
OBZ
---
--
R1
O5′ O
4′
1′
3′ 2′
O
R2- O-P=O
O
5′ O
4′
1′
3′ 2′
O
R2- O-P=O
O-
二、化学合成DNA片断的组装
化学合成的DNA单链片断一般在200 bp以内 1. 互补连接法 （1）互补配对
合成的片断之间都要有互补区域
ln (1-p) N= ln (1-f)
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因
组DNA的百分数 N：所需的重组载体数（克隆数）
ln (1-p) N= ln (1-f)
=
ln (1-99%) ln (1-f) =
4.61×
G F
G：基因组（Genome）大小 F：克隆片段（Fragment）大小
5′
（1）原理
保护5′—活化3′—连接—脱保护
3′
l
HO-P=O
1）保护dNTP的5′端
l
2）乙酸保护另一个dNTP的3′-OH
3）带保护的单核苷酸连接成磷酸二酯键
4）脱3′乙酸
缺点：磷酸上的侧位OH影响以后的反应
（2）合成过程
DCC （或TsCl）
RH1O5′ O
4′
1′
3′ 2′
OH
---
HO
5′
cDNmAR第NA二链
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA333′′′
3′
cDNA第一链
TTTTTTTT5′
3）克隆cDNA ①修平cDNA末端 T4 DNA Pol 补平和修平
5′
cDNA第二链
AAAAAAAA3′
3′
cDNA第一链
TTTTTTTT5′
②用T4 ligase加linker，限制酶切出粘性末端 ③末端转移酶同聚物加尾
3′ CG TTTTTTTT 5′
（1）12种3′端的3′锚G定G引T物TT扩TT增TTcTDN5A′ 第一链
3′ TG TTTTTTTT 5′
Oligo(dT)引物的3′端加两个核苷酸
3′ AA TTTTTTTT 5′
3′ CAmRTNTATTTTTT 5′
5′
3’ NG′AM′TATATATATTATATAA5’AAAAAAAA 3′
文库 1
23
4
56
探针
放射自显影
测序分析
第四节 目的基因的分离和扩增
一、目的基因的分离
富集特定基因的mRNA或cDNA模板 1. 探针柱分离特异mRNA
根据已知的基因序列合成探针，结合到纤 维素柱上，分离纯化该基因的mRNA
Total RNA
探针DNA mRNA
探针DNA mRNA
探针DNA mRNA
探针DNA mRNA
探针DNA
只有与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它RNA流走
2. mRNA消减杂交（subtractive hybridization） 分离某种组织特异性表达的mRNA
（1）羟基磷灰石（Hydroxylapatite, HA）柱 更容易结合DNA-RNA或DNA-DNA双链， 不容易结合单链DNA
3′ TA TTTTTTTTTTTTTT55′ ′
33′′ ANCMTTTTTTTTTTTTTTTT55′′
3′ CC TTTTTTTT 5′
M：A、G or C3′ GC TTTTTTTT 5′ N: A、G、T3o′ rTCC TTTTTTTT 5′
（2）5′端的随机引物 扩增cDNA第二链
20种10 mer 5′ NNNNNNNNNN 3′ 3′ NM TTTTTTTT 5′
一、基因文库的构建
1. 基因文库（Gene library） 将某种生物的 完整基因组DNA切割成大小合适 的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接， 转入相应的 细菌 细胞中保存和扩增
2. 构建基因文库的载体选用 （1）载体的克隆能力 能插入大片段外源DNA
（2）常用的载体 λ载体系列： 容量 <24 kp cosmid载体： 容量 <50 kb YAC： 容量 <1 Mb BAC: 容量 约300 kb
5. cDNA文库的大小 要包含99%的mRNA时所需要的菌落数目
ln (1-p)
N=
ln
(1-
1 n
)
p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） 1 n : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细
胞整个mRNA的比例
N：所需的重组载体数（克隆数）
三、文库的查询（screening）
用目的基因探针与文库中的重组载体进行杂交
（2）5′-OH磷酸化 合成的DNA单链的5′端是-OH
（3）连接酶连成完整双链
有互补区域的单链组装
5′5H′PO-3′HO-
5′H5′OP--
-OH3′
-OH3′ 3′HO-
5′H5′OP--OP5H′ 5′
-OP5H′ 5′
3′HO-
-OH3′ -OP5H′ 5′
T4多核苷酸激酶 T4 DNA连接酶
4. 构建cDNA文库的一般步骤
（1）提取总RNA（total RNA） mRNA只占总RNA的1%～2%
（2）分离纯化mRNA Oligo dT Column:
总RNA
滞留带PolyA尾的mRNA
（3）cDNA的合成 1）cDNA第一链的合成 用Oligo dT作引物，合成cDNA的第一链 碱或RNaseH 降解RNA-DNA中的mRNA
EcoRI adaptor AATTC
G AATTC
G EcoRI
T4 Ligase
G CTTAA G CTTAA
3）同聚物加尾
末端转移酶 dGTP dCTP
CCC
CCCC
Klenow T4 Ligase
抗生素 （3）载体与大片段DNA连接后转化宿主菌
所有带有重组载体的菌落
4. 基因组文库的大小 包含基因组DNA的99%时所需要的菌落数目
GCT
4. 设计PCR引物的一般流程 （1）获取目基因的DNA序列 NCBI检索： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Izumo1
（2）用软件设计引物 1）专业软件： Oligo 7；Primer Premier 6等 2）在线软件: 如NCBI的Primer BLAST
5′
mRNA
AAAAAAAA3′
cDNA第一链
3′ TTTTTTTT 5′
反转录酶
2）cDNA第二链的合成 ① 利用cDNA第一链3′端的弯曲自身引导
3′ 5′ 3′
cDNA第一链 cDNA第二链
DNA Pol
TTTTTTTT5′ AAAAAAAA3′
核酸酶S1 切掉发卡结构
②用RNaseH置换合成，T4 ligase 连接片段
HO-P=O O5′ O
4′
1′
3′ 2′
AcHO
HO
HO-P=O O5′ O
4′
1′
3′ 2′
AHc O
2. 磷酸三酯法（1960s, R. Letsinger and C. Reese） 单核苷酸在3′-P和5′-OH上都先连接一个保护基团
R1HO
5′ O
4′
1′
3′ 2′
--
O
R2H- O-P=O
பைடு நூலகம்
2. 互补延伸连接法 片断之间有局部互补区，可以相互作为引物， 用DNA聚合酶（或PCR）延伸成完整的双链
Klenow T4DNA连接酶
5′
3′ 5′
3′
3′
5′
引物
三、 化学合成DNA的用途
1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难制作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低
2. 合成引物（20 mer左右） 3. 合成探针序列（100～200 mer） 4. 定点突变合成 5. 合成人工接头或衔接物
mRNA
上
上
PolyA
T
下下
3. 基因的体外诱变
在DNA的某处引入突变（缺失、插入、替换等）
5′TAATTCCGTACGATCTG 3′ATGCTGGCATGCTAGAC 5′TACGACCGTACGATCTG 3′ATGCTGGCATGCTAGAC
5′TAATTCCGTACGATCTG 3′ATTAAGGCATGCTAGAC 5′TAATTCCGTACGATCTG 3′AT GGCATGCTAGAC
Sau3AI：↓GATC
2）4 bp酶切的优点 随机程度高，不易遇到大片段内无切点的现象 易获得重叠片断 在部分酶切条件下能得到15～20 kb 片断
Sau3AI 部分酶切
2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用
约300 bp的随机片段 （2）高速搅拌
1500 r/min下搅拌30 min
3. 基因文库构建的一般步骤 （1）制备大片段染色体DNA
断点完全随机，片断长度合适于载体连接
1）物理切割法： 超声波（300 bp）或机械搅拌（8 kb）
2）酶切法： Sau3AI: 可得到10～30 kb的随机片断
（2）载体与基因组DNA大片段连接 1）同尾酶粘性末端直接连接 如：Sau3AI与BamHI的酶切末端 2）人工接头法（adapter）
5′ 3′ 5′
A组织 B组织
240组cDNA第二链 12类cDNA第一链
mRNA
3′ 5′ PolyA 3′
二、PCR扩增获得目的基因
要求基因（或cDNA）序列已知（设计引物） 1. 直接从原核生物基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增
2. 从真核mRNA中扩增: RT-PCR （1）提取细胞（或组织）的 total RNA （2）反转录（RT）合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增
2000
1 265 1460 1493
mouse
（3）Primer BLAST检查引物的特异性
2000 mouse
BamHI
BamHI BamHI BamHI BamHI
Target gene
二、随机片断化
1. 限制性内切酶不完全消化法 （1）限制性内切酶的选用原则 1）内切酶识别位点的碱基数 4 bp：平均44 =256 bp一个切点 6 bp：平均46 =4096 bp一个切点
HaeIII： GG↓CC
（常用）4 bp酶： AluI： AG↓CT
例如：人的基因组是 3×109 bp，如果插入DNA 片断的平均长度是1.7×104 bp
G N=4.61× F
=
4.61×
3×109 1.7×104
= 8.1×105
二、 cDNA文库的构建
1. cDNA（complementary DNA）
5′
mRNA
AAAAAAAA3′
cDNA第一链
3′ TTTTTTTT 5′
约8 kb的随机片段
第二节 化学合成目的基因
H.G. Khorana于1976年合成大肠杆菌酪氨酸抑制tRNA基因
一、常用的方法及其原理
磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化合成法
Har Gobind Khorana 1922－2011
1. 磷酸二酯法（1950s, Khorana ）