病毒学实验(抗原抗体检测)细菌学实验的详细实验步揍
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各实验具体步骤:
病毒学实验
1.抗体检测:
有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞,称为血凝现象,血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验,原理是相应抗体与病毒结合后,阻止病毒表面HA与红细胞结合,常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查,也可用于鉴定病毒型与亚型。
疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
目的意义:
1.掌握血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HAI)的基本方法;
2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
基本原理:
许多病毒表面具血凝素,具有凝集某些动物或人红细胞的特性,称为血凝现象,可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制,称为血凝抑制现象,利用这种特性可进行血清学试验,称为血凝抑制试验。
器材及试剂:
待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液;待检血清:抗鸡新城疫病病毒阳性血清;生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
实验步骤:
(一)血凝试验(HA)取96孔板,按以下步骤操作:
1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul,第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照;
2、吸25ul病毒液于第一排第1孔,混匀后取25ul至第2孔,依次稀释至第12孔,弃去25ul,
3第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。
4、室温静置10-30分,观察结果
5、结果判定:红细胞对照组红细胞完全沉降,以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数,作为病毒的血凝价,即HI效价
(二)血凝抑制试验(HI)取一96孔板,按以下步骤操作:
1、4个单位抗原的制备:按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释
度。
(根据学农实验配置4单位抗原,以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗原的稀释倍数。
2、待检血清的稀释:第一、二、三排1-12孔各加生理盐水25ul,于第一排第1孔中加入25ul待检血清,反复吹吸3-5次混匀后,取25ul至第2孔混匀,吸取25ul至第3孔,依次稀释至第12孔,弃去25ul,经倍比稀释
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素25ul,微量震荡器震荡2min混匀;
4、室温静置20min;
5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul,微量震荡器震荡2min混匀混匀。
6、室温静置10-30分,观察结果。
将板倾斜,观察红细胞有无成泪滴状流淌。
完全血凝(不流淌)的抗原货病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位。
ELISA(酶联接免疫吸附剂测定)
是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理
ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤
方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
(简称洗涤,下同)。
2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
方法二用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。
次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应
孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的
4、5、6。
(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): Na2CO3
1.59克,NaHCO3
2.93克,加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS):0.15M,KH2PO4,0.2克,
Na2HPO4·12H2O 2.9克, NaCl,8.0克, KCl 0.2克,Tween-20 0.05%0.5ml ,加蒸馏水至1000ml, (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克,加洗涤缓冲液至100ml,或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5~10%使用。
(4) 终止液(2M H2SO4):蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸): 0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml , 0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液: TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml 0.75%H2O232μl
(7) ABTS使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3%H2O22μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔,ELISA检测仪,50μl及100μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。
抗原检测
1.PCR
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链,在DNA聚合酶与引发子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做引发子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR反应步骤
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
1、模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2、模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3、引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的"半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。
2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
(Plateau)。
到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
Taq DNA 聚合酶
现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 是于1976年从温泉中的细菌(Thermus aquaticus)分离出来的。
发现耐热DNA聚合酶--Taq 酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现"停滞效应" 这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA
聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 5ul 4种dNTP混合物各200μmol/L引物
各10~100pmol 模板DNA 0.1~2μg Taq DNA聚合酶 1~2 U Mg2+ 1.5~2.0mmol/L 加双或三蒸水至50μl
PCR反应五要素
*引物(Primer)
*酶(Taq DNA Polymerase) *dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)*模板(Template)
*Mg2+(Magnesium)
引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板DNA 序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
1、引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
避免引物内部出现二级结构,避免。