抗血清制备及抗体效价检测

短期免疫抗血清制备及抗体效价检测

黄健，应技1201,2012304200315

摘要通过一定程序注射颗粒性抗原或可溶性抗原免疫小鼠和家兔，是实验室制备多克隆抗血清的常用方法。虽然依据常规免疫方案可以制备出效价高、亲和力强的抗血清，但整个常规方案耗时近１个多月，也容易受到免疫动物健康状况的影响和饲养成本的限制。本试验以牛血清白蛋白为抗原缩短免疫注射周期，对小鼠和家兔进行短程快速免疫。并进行效价检测，以探讨短程快速免疫方案的实效性。

关键词免疫，抗血清，抗原，ELISA

主线实验分为三个小实验分别为：实验一：免疫小鼠（每组一只），家兔（每班一只）。实验二：对免疫后的小鼠和家兔进行抽血、放血，其中老鼠采用断尾取血家兔采用颈动脉放血，分离抗血清。实验三：ELISA测定抗体效价。另有一个穿插实验：血型鉴定。

1 实验一：免疫

用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。为了制备高效价的抗血清，我们需要考虑下列五个因素。实验动物的免疫反应性，抗原的免疫原性，抗原的剂量，免疫途径，免疫时间间隔。

1.1实验动物的选择

常用的免疫动物有家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。家兔一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。同时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。我们此次选用小白鼠（每组一只），家兔（每班一只）。

1.2实验步骤

1).编号标记

3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸酒精饱和液分别标记左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。

2).免疫

合成免疫原为2mg(半抗原约为20～200 μg)。家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。首免需要与等体积的福氏完全佐剂混合，二免与等体积的不完全福氏佐剂混合，三免、四免不用佐剂。

家兔可采用皮下（脚掌），皮内，耳静脉，肌肉，淋巴结等不同部位进行免疫。

小鼠则采用腹腔注射，方法为以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。（为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。）

2实验二：抽血、放血，分离抗血清

2.1取血

1).老鼠采用断尾取血

将小鼠放入一个盖子上打孔的恰好能放进老鼠的离心管中，尾吧从盖子孔中穿出用以固定小鼠。先用酒精棉球对小鼠尾部末端消毒，然后用消毒后的手术剪剪断小鼠尾部末端。用1ml离心管接血，为了让血液尽可能快的流出，可用手从上而下按摩小鼠尾部。

2).家兔采用颈动脉放血

家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。（注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！）

2.2抗血清的分离，保存

斜置装血液的三角瓶0.5-1h；用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；

原样包扎好三角瓶，与装有小鼠血液的离心管一同做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；

次日（时间待定）：估计各班分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！！），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。

3实验三：ELISA法测定抗体效价

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 ELISA过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。

3.1实验材料

牛血清白蛋白（BSA)——抗原，10 μg/ml溶液，包被液配制

鼠抗BSA——待测抗体样品，用PBST从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度

HRP标记羊抗小鼠IgG ——二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。每班

8个板，480孔，总量48000 μ l，实际5.5 μ l到55ml）

包被缓冲液：0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）

0.01M PBS溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g， KH2PO4 0.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4）

PBST洗涤液：含0.05 % Tween 20的0. 0001 M 的PBS（ pH 7.4 ）

底物溶液：TMB（ 3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺）

2M H2SO4 （市售浓硫酸为18.4 M，根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）

酶标板，酶标仪，保鲜膜，排枪

3.2实验步骤

1).加抗原：

取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）

2).包被抗原：

保鲜膜包好， 37℃ 1h或4 ℃过夜

抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上

3).封闭：

甩干后以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次

每孔加入100 μl 5%（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）

保鲜膜包好， 37℃， 2h

4).加待测血清

取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体

以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次

标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔

（用PBST稀释，按示意图用单枪加）

37℃，保鲜膜包好，60min

5).加二抗：

甩干孔内液体

以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次

各孔加入酶标二抗100μl/孔（用PBST稀释10000X,全班每8板需48ml，实配55ml）

37℃，保鲜膜包好，45min

6).显色：

甩干孔内液体

以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次

加入TMB底物溶液50μL/孔