微生物致病菌快速检测技术

微生物致病菌快速检测技术

作者：张华锋

来源：《现代经济信息》2009年第23期

摘要:从原理、特点及应用等方面对食源性微生物致病菌的免疫及分子检测新技术作一概述,期望为致病菌监测提供参考。

关键词:致病菌免疫学聚合酶链反应基因芯片

食品中的生物性污染无论是在发达国家还是发展中国家都是影响食品安全的最主要原因,致病性微生物是对消费者健康危害最大的食品安全问题。要确定食源性微生物致病菌在食物链中相关的食品,寻找预防食品污染的关键环节则依赖于对致病菌的监测能力和水平。

传统的检测方法无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测,而且耗时费力,获得结果通常需要几天的时间,不能实现有效的监测、预防作用。因此,发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法是及时有效地控制和预防致病菌传播的前提。本文从原理、特点及应用等方面对食源性致病菌的免疫学及聚合酶链反应、基因芯片等检测新技术进行综述。

1. 免疫学检测技术

免疫学检测技术将抗原、抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合,是一种可以定位、定性和定量的综合技术,具高专一性和高敏感度。

1.1 酶联免疫吸附检测(ELISA)。1971年Engvall建立了ELISA方法,它以酶或者辅酶作为标记物,标记抗原或者抗体,用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应,并且利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体,使其固相化,在其中进行免疫反应和酶促反应。ELISA具有选择性好、结果判断客观准确、实用性强、样品处理量大等优点,弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试手段的不足。但ELISA对试剂的选择性高,很难同时分析多成分;对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应;对分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。

1.2 免疫磁性分离技术。免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面,与样品中被检致病菌发生特异性的结合,载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,弃去检样混合液,使致病菌不断得到分离、浓缩。免疫磁性分离技术代替了常规的选择性增菌培养过程,可特异有效地将目的微生物从样品中快速的分离出来。

1.3 免疫胶体金技术。免疫胶体金技术起源于1971年Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门氏菌。其基本原理是以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合,再用胶体金结合物标记而达到检测目的。其特点是单份测定、简单快速、特异敏感、不需任何仪器设备和试剂,几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果,并可保存实验结果。

2. 聚合酶链反应(PCR)检测方法

聚合酶链反应(PCR)是近十多年来应用最广的分子生物学方法,在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物进行扩增,进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。其中,依赖PCR的DNA指纹图谱技术、多重PCR检测技术(m.PCR)、定量PCR检测技术等应用最为广泛。

2.1 依赖PCR的DNA指纹图谱技术。依赖PCR的DNA指纹图谱技术是通过各种改进的PCR技术,使目标微生物的核酸经扩增后,产生多条DNA扩增片段(特异性和非特异性的),通过统计分析,找出某种微生物的特有条带,进行区别鉴定。

2.1.1随机引物扩增DNA多态 (RAPD)。随机引物扩增DNA多态性主要用于不考虑微生物核酸精确序列的情况下,比较微生物间的DNA指纹图谱差异,用于细菌种问的鉴定,Black等[8]将毛细管热循环仪及RAPD技术用于李斯特氏菌(Listeria Pirie)的鉴定,3h即可出结果。Louie等比较了核酸分型技术、RAPD和脉冲场凝胶电泳技术,用于李斯特菌的分型鉴定,结果显示后两种方法效果较好。但是RAPD的不足之处是需对大量的随机引物进行筛选,且有时扩增的条带不很稳定。

2.1.2 基因内重复性一致序(ERIC)的扩增。ERIC片段是存在于肠道细菌核酸中的重复DNA 序列,长126bp,含有一段高度保守的中心反转重复序列,分布在细菌染色体的不同位点上且以不同的距离分隔,因此,以这些重复的DNA片段作为PCR扩增时引物的结合位点,使其被分隔的片段大量扩增,在凝胶电泳上形成一系列的条带,从而区分不同的肠道细菌。Versalovio等[10]曾用与ERIC重复序列互补的寡核苷酸片段作为引物及斑点杂交DNA探针来检测包括大肠杆菌

(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)等不同菌种间存在的特异DNA指纹图谱。与RAPD相比,此法引用的引物序列固定,结果的重复性更好。

2.2 多重PCR检测技术(m-PCR)。PCR技术已经运用于食品中单一致病菌的检测, 并得到一定程度的推广,但食品中往往含有多种致病菌。多重PCR的建立,实现了多种食源性致病菌的同时检测。M.PCR是指在同一个反应体系中,加入多对特异性引物,如果存在与各引物对特异性互补的模板,即可同时在同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段,实现了一次性检测多种致病菌的目的。

我国学者严笠等[13]应用m.PCR,在同一扩增体系中同时扩增了大肠埃希氏菌

O157:H7(Escherichia coli 0157:H7)、沙门氏菌(Salmonella spp.)和志贺氏菌(Shigella spp.)特征性基因,最后通过凝胶电泳实现了这三种致病菌的的同时快速检测,取得理想结果。m.PCR既保留了常规PCR的特异性、敏感性,又减少了操作步骤及试剂。但也存在较明显的不足:扩增效率不高、敏感性偏低;扩增条件需摸索与协调;可能出现引物间干扰等。

2.3 定量PCR检测技术。定量PCR检测技术是对传统定性PCR技术的发展和补充,即在PCR反应体系中加入标记物,通过标记物的表达量,在定性的同时实现定量。

2.3.1 内标定量PCR。内标定量PCR采用终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,建立常规PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重显性极差。因此,无法直接从终点产物量推算出起始模板量,而加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性,达到定量。

2.3.2实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR技术无须内标物,而是在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,有效地解决了内标定量PCR只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值(每个反应内的荧光信号到达设定的域值

所经历的循环数,Cycle threshold)计算,根据标准曲线得定量结果。实时荧光定量PCR将DNA扩增和分子杂交同步进行,且采用了闭管检测,扩增后无须电泳,自动化程度高,减少了污染的可能性,提高了检测的灵敏度和特异性。

3. 基因芯片技术

基因芯片(gene chip)是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵列。其检测致病菌原理为:相关细菌的特异性基因(如毒力基因、抗生素耐受基因) 和基因库中的rDNA序列设计玻片上的片断,这种方法可以快速、准确地检测和鉴定食物中的

病原菌。