基因表达谱分析技术

基因表达谱分析技术

1、微阵列技术（microarray）

这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸），并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。包括cDNA芯片（cDNA microarray）和DNA 芯片（DNA chips）。

cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cm×18cm的膜上。尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA片段。要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂

交。洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。使用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基因表达的差异，只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片灵敏度更高，而且可以使用2种探针同时与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作带来的差异；缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。

Guo等（2004）将包含104个重组子的cDNA文库点在芯片上，用于检测拟南芥叶片衰老时的基因表达模式，得到大约6200差异表达的ESTs，对应2491个非重复基因。其中有134个基因编码转录因子，182个基因预测参与信号传导，如MAPK级联传导路径。Li等（2006）设计高密度的寡核苷酸tiling microarray方法，检测籼稻全基因组转录表达情况。芯片上包含13,078,888个36-mer寡核苷酸探针，基于籼稻全基因组shot-gun测序的序列合成，大约81.9%（35,970）的基因发生转录事件。Hu等（2006）用含有60,000寡核苷酸探针（代表水稻全部预测表达基因）的芯片检测抗旱转基因植株（过量表达SNAC1水稻）中基因的表达情况，揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。

2、基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE）

基因表达系列分析（SAGE）是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、有效的技术，也是一种高通量的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进行量化研究（Velculescu et al., 1995）。SAGE的基本原理是：每一条mRNA序列都可以用它包含的9bp的小片段（TAG）代替，因此考查这些TAGs 出现的频率就能知道每一种mRNA的丰度。首先利用生物素标记的oligo（dT）引物将mRNA反转录成双链cDNA，然后利用NlaIII酶切双链cDNA。NlaIII酶的识别位点只有4bp，因此cDNA都被切成几十bp的小片段。带有生物素标记的小片段cDNA被分离出来，平均分成2份。这2份cDNA分别跟2个接头连接，2个接头中均有一个FokI 酶切位点。FokI是一种II S型核酸内切酶，其识别位点不对称，切割位点位于识别位点下游9bp且不依赖于特异的DNA序列。FokI酶切分成2份的cDNA之后，带有部分接头序列的TAGs就被释放下来。这时将2份cDNA混合起来，进行连接反应。根据接头序列设计引物扩增连接反应的产物，然后通过NlaIII酶切PCR产物得到连接在一起的两个TAG，即ditag。将ditags串连起来，克隆到质粒载体中。一般每个克隆包含50个左右的ditags。这些克隆经过PCR扩增然后测序。因为每一个ditag之间都是以NlaIII识别位点间隔的，所以很容易对每个的ditag进行区分和计数。而每一个TAG在SAGE库中出现的频率就代表了该基因的表达水平。利用SAGE可以在短期内得到丰富的表达信息，与直接测定cDNA克隆序列方法相比，减少了大量的重复测序，从而大大节省了研究时间和费用。这种方法对正常、癌基因旁、

癌组织中基因的差异表达研究方面还有独到的优点，有助于发现肿瘤特异基因。

首次运用SAGE技术是分析1000个胰腺基因的表达情况（Velculescu et al., 1995），结果都显示它是一种有效的功能基因组研究方法。最早用SAGE技术进行研究的高等植物是水稻（Matsumura et al., 1999）。运用SAGE技术检测了水稻中来源于6000个基因10000个TAGs。SAGE分析显示绝大部分高表达基因都是看家基因，这些基因的mRNA在总RNA中的比例超过1％。在无氧处理和对照的幼苗中分析了2000个左右的TAGs，结果显示多数基因的表达没有变化。有趣的是，发酵途径相关的基因同样没被检测到。根据TAG序列设计引物，成功扩增出了延伸因子EF-1a 0.2kb的cDNA片段。这一事实说明利用9bp的TAG序列和4bp的NlaIII识别位点序列，可以设计引物用于长片段cDNA的获得。

3、cDNA-AFLP

cDNA-AFLP是从基因组AFLP方法（V os et al., 1995）发展来的RNA指纹技术。经典的cDNA-AFLP按照标准的AFLP方法进行操作，只不过模板变成了cDNA。这一方法包含3个步骤：

a. 将cDNA酶切并连上载体；

b. 利用包含选择性碱基的引物进行扩增；

c.电泳及成像。一般选择两种限制性内切酶进行cDNA的消化，这两种酶一种的酶切位点为4个碱基，另一种为6个碱基。在植物基因组的AFLP操作中，需要添加3个进行选择性扩增。因为cDNA的复