分子克隆常用工具酶
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植物基因工程
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
植物基因工程
“星”活性Star activity “星”活性
活性： 高浓度的酶、 高浓度的甘油、 “ 星 ” 活性 ： 高浓度的酶 、 高浓度的甘油 、 低离子强度、 极端ppH值等 ， 会使一些核酸内切 值等， 低离子强度 、 极端 值等 酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 在名称右上角加一个星号(*)表示 如 在名称右上角加一个星号 表示 ,如 EcoRⅠ*： Ⅰ ： AATT ；EcoRⅠ：GAATTC Ⅰ 必须采用规范的实验步骤, 必须采用规范的实验步骤 应用推荐的反应条 件。
植物基因工程
DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5 10倍 DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5-10倍 DNA浓度高 浓度 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故 平末端的连接效率比粘性末端要低得多， 在平末端连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA DNA连接酶的浓度和外源 连接酶的浓度和外源DNA 在平末端连接反应中， 及载体DNA浓度均要求较高。 及载体DNA浓度均要求较高。 DNA浓度均要求较高 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 防止环化： 时间：过夜最好 时间：
植物基因工程
植物基因工程
植物基因工程
不同限制性内切酶切割的三种结果
植物基因工程
植物基因工程
植物基因工程
同尾酶
5`---GGATCC---3` 5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5` 3`---CCTAGG---5` Bam HⅠ HⅠ 5`---G 5`---G 3`---C CTAG 3`---C GATC C---3` C---3` G---5` G---5` 5`---AGATCT---3` 5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5` 3`---TCTAGA---5` Bgl II 5`---A 5`---A 3`---T 3`---T CTAG
应用范围
窄
植物基因工程
三、DNA连接酶的反应条件 连接酶的反应条件
连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。 连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数 是影响转化效率的最重要参数 内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下， 内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持 Tm值在15℃以下 连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 但在该温度下， 但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳 定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适 定的，因此最适温度是粘性末端的Tm Tm值和连接酶最适 温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。 16℃过夜 温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。
植物基因工程
植物基因工程
二、常用连接酶 两种DNA连接酶比较
T4 DNA ligase 来源 分子量 辅助因子 底物 T4 噬菌体 60000 ATP 双链DNA分子的粘、平端 双链 分子的粘、 分子的粘 RNA-DNA杂合体，RNA链 杂合体， 杂合体 链 缺口、双链DNA分子中的 缺口、双链 分子中的 单链缺口 广泛、 广泛、效率高 E.coli DNA ligase 大肠杆菌 75000 NAD+ 同源互补粘端 双链分子中的单链缺口
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA 头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 DNA片段连接 DNA分 子。
植物基因工程
限制性内切酶
Restriction enzymes
“分子 剪刀” 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。 EcoRI, 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, DNA双链切开 HpaI
植物基因工程
三、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd，单链多肽， 一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 6～8 60kd NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活， NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 有抑制作用 Mg2+激活 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复 环境 冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油， 冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 50 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
第二章 分子克隆常用工具酶
田振东 Tianzhd@mail.hzau.edu.cn Tel: 87286939 Office: 园林楼 园林楼620
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性 - 极性
• • • 两条单链间以氢键连接 两条单链，极性相反，反向平行 两条单链，极性相反， 以中心为轴， 以中心为轴，向右盘旋
植物基因工程
GATC T---3` T---3` A---5` A---5`
植物基因工程
四、影响酶切反应的条件*
温度：一般37 37℃ ① 温度：一般37℃ 盐离子浓度：Na＋ Mg2 ② 盐离子浓度：Na＋，Mg2＋ 缓冲体系： 环境的Tris-HCl缓冲 缓冲体系 DTT用于保持 用于保持酶 ③ 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的Tris-HCl缓冲体系 DTT用于保持酶 稳定性和活性 稳定性和活性 ④ 反应体积和甘油浓度： 反应体积和甘油浓度： 商品化的限制性内切核酸酶均加50 甘油作为保护剂，一般在-20℃ 商品化 的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在-20℃ 的限制性内切核酸酶均加50％ 保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10 10％ 保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度 过高， 过高，影响酶切反应 ⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 反应时间：通常为1 进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 DNA DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质 有机溶剂、 RNA等杂质会影 样品中所含的蛋白质、 ⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNA等杂质会影 响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位 响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位 DNA 置会影响酶切反应。 置会影响酶切反应。
植物基因工程
限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
植物基因工程
一、限制性核酸内切酶的分类 限制性核酸内切酶的分类
植物基因工程
二、 限制性核酸内切酶的命名原则
名 称 属 名 种 名 株 名 序 号 菌株来源
EcoRⅠ EcoRⅠ E HindⅡ HindⅡ HpaⅠ HpaⅠ
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整 体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即 5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链
植物基因工程
每一种酶都有各自特异识别位点 每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列， 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 ， 为7bp～8bp，甚或多于 ～ ， 8bp。 。 多数限制酶的识别序 列为回文结构， 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 列内或其附近水解 链 中的磷酸二酯键。 中的磷酸二酯键。
co R
Ⅰ Ⅲ Ⅱ Ⅰ
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
Hind Ⅲ H in d H in d H pa /
Hind Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中 代表从流感噬血杆菌( influenzae) 分离到的第3个限制酶。 分离到的第3个限制酶。
植物基因工程
1）粘性末端DNA片段的连接 粘性末端DNA DNA片段的连接
植物基因工程
2)平末端DNA片段的连接 2)平末端DNA片段的连接
直接用T DNA连接酶连接 效率不高，较少采用。 连接酶连接： a. 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。 同聚物加尾连接平末端DNA片段 连接平末端DNA片段： b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转 移酶， 给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA DNA分子加上同聚物尾巴后再用 移酶 ， 给平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴后再用 DNA 连接酶进行连接 用衔接物连接平末端DNA分子 平末端DNA分子： c. 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点， 上构建限制性核酸内切酶酶切位点 ， 经酶切后产生 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接 DNA
源自文库植物基因工程
常用的工具酶性质及功能
工具酶名称 限制性内切核酸酶 Restriction endonucleases DNA连接酶 连接酶 DNA ligase DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 DNA polymerase I 多核苷酸激酶 DNA polymerase kinease 反转录酶 Reverse transcriptase DNA末端转移酶 末端转移酶 DNA terminal transferase 降解酶 S1 nuclease S1 Taq DNA 聚合酶 Taq DNA polymerase 主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
植物基因工程
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
植物基因工程
核酸合成酶类
核酸修饰酶类
用于核酸操作的常用工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
植物基因工程
植物基因工程
Replication
植物基因工程
分子克隆操作过程：
克隆目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割 和连接，制成重组DNA→导入宿主细胞→筛选、鉴定 →扩增和表达。
植物基因工程
工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、 聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来， 需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需 要 DNA 聚合酶（polymerase）等。 因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
植物基因工程
位点偏爱（ 位点偏爱（site preference） ） 某些限制性内切酶对不同位置的 同一个识别序列表现出不同的切割 效率。 效率。
植物基因工程
第二节 DNA连接酶 DNA Ligase 连接酶
植物基因工程
一、DNA连接酶性质 连接酶性质
定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的 DNA上裂口两侧 定义：催化DNA上裂口两侧(相邻) 3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯 羟基和5 键，使断开的DNA裂口连接起来 使断开的DNA 功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、 功能：具有修复单链或双链的能力, DNA重组、 重组 复制和损伤后的修复中都起关键作用。 复制和损伤后的修复中都起关键作用。
植物基因工程
第一节 分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀” 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。 EcoRI, DNA双链切开 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶” 分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平 DNA连接酶 连接酶——
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
植物基因工程
“星”活性Star activity “星”活性
活性： 高浓度的酶、 高浓度的甘油、 “ 星 ” 活性 ： 高浓度的酶 、 高浓度的甘油 、 低离子强度、 极端ppH值等 ， 会使一些核酸内切 值等， 低离子强度 、 极端 值等 酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。 在名称右上角加一个星号(*)表示 如 在名称右上角加一个星号 表示 ,如 EcoRⅠ*： Ⅰ ： AATT ；EcoRⅠ：GAATTC Ⅰ 必须采用规范的实验步骤, 必须采用规范的实验步骤 应用推荐的反应条 件。
植物基因工程
DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5 10倍 DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5-10倍 DNA浓度高 浓度 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故 平末端的连接效率比粘性末端要低得多， 在平末端连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA DNA连接酶的浓度和外源 连接酶的浓度和外源DNA 在平末端连接反应中， 及载体DNA浓度均要求较高。 及载体DNA浓度均要求较高。 DNA浓度均要求较高 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 防止环化： 时间：过夜最好 时间：
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植物基因工程
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不同限制性内切酶切割的三种结果
植物基因工程
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同尾酶
5`---GGATCC---3` 5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5` 3`---CCTAGG---5` Bam HⅠ HⅠ 5`---G 5`---G 3`---C CTAG 3`---C GATC C---3` C---3` G---5` G---5` 5`---AGATCT---3` 5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5` 3`---TCTAGA---5` Bgl II 5`---A 5`---A 3`---T 3`---T CTAG
应用范围
窄
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三、DNA连接酶的反应条件 连接酶的反应条件
连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。 连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数 是影响转化效率的最重要参数 内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下， 内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持 Tm值在15℃以下 连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 但在该温度下， 但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳 定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适 定的，因此最适温度是粘性末端的Tm Tm值和连接酶最适 温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。 16℃过夜 温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。
植物基因工程
植物基因工程
二、常用连接酶 两种DNA连接酶比较
T4 DNA ligase 来源 分子量 辅助因子 底物 T4 噬菌体 60000 ATP 双链DNA分子的粘、平端 双链 分子的粘、 分子的粘 RNA-DNA杂合体，RNA链 杂合体， 杂合体 链 缺口、双链DNA分子中的 缺口、双链 分子中的 单链缺口 广泛、 广泛、效率高 E.coli DNA ligase 大肠杆菌 75000 NAD+ 同源互补粘端 双链分子中的单链缺口
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA 头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 DNA片段连接 DNA分 子。
植物基因工程
限制性内切酶
Restriction enzymes
“分子 剪刀” 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。 EcoRI, 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, DNA双链切开 HpaI
植物基因工程
三、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd，单链多肽， 一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 6～8 60kd NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活， NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 有抑制作用 Mg2+激活 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复 环境 冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油， 冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 50 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
第二章 分子克隆常用工具酶
田振东 Tianzhd@mail.hzau.edu.cn Tel: 87286939 Office: 园林楼 园林楼620
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性 - 极性
• • • 两条单链间以氢键连接 两条单链，极性相反，反向平行 两条单链，极性相反， 以中心为轴， 以中心为轴，向右盘旋
植物基因工程
GATC T---3` T---3` A---5` A---5`
植物基因工程
四、影响酶切反应的条件*
温度：一般37 37℃ ① 温度：一般37℃ 盐离子浓度：Na＋ Mg2 ② 盐离子浓度：Na＋，Mg2＋ 缓冲体系： 环境的Tris-HCl缓冲 缓冲体系 DTT用于保持 用于保持酶 ③ 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的Tris-HCl缓冲体系 DTT用于保持酶 稳定性和活性 稳定性和活性 ④ 反应体积和甘油浓度： 反应体积和甘油浓度： 商品化的限制性内切核酸酶均加50 甘油作为保护剂，一般在-20℃ 商品化 的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在-20℃ 的限制性内切核酸酶均加50％ 保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10 10％ 保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度 过高， 过高，影响酶切反应 ⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 反应时间：通常为1 进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 DNA DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质 有机溶剂、 RNA等杂质会影 样品中所含的蛋白质、 ⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNA等杂质会影 响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位 响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位 DNA 置会影响酶切反应。 置会影响酶切反应。
植物基因工程
限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
植物基因工程
一、限制性核酸内切酶的分类 限制性核酸内切酶的分类
植物基因工程
二、 限制性核酸内切酶的命名原则
名 称 属 名 种 名 株 名 序 号 菌株来源
EcoRⅠ EcoRⅠ E HindⅡ HindⅡ HpaⅠ HpaⅠ
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整 体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即 5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链
植物基因工程
每一种酶都有各自特异识别位点 每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列， 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 ， 为7bp～8bp，甚或多于 ～ ， 8bp。 。 多数限制酶的识别序 列为回文结构， 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 列内或其附近水解 链 中的磷酸二酯键。 中的磷酸二酯键。
co R
Ⅰ Ⅲ Ⅱ Ⅰ
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
Hind Ⅲ H in d H in d H pa /
Hind Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中 代表从流感噬血杆菌( influenzae) 分离到的第3个限制酶。 分离到的第3个限制酶。
植物基因工程
1）粘性末端DNA片段的连接 粘性末端DNA DNA片段的连接
植物基因工程
2)平末端DNA片段的连接 2)平末端DNA片段的连接
直接用T DNA连接酶连接 效率不高，较少采用。 连接酶连接： a. 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。 同聚物加尾连接平末端DNA片段 连接平末端DNA片段： b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转 移酶， 给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA DNA分子加上同聚物尾巴后再用 移酶 ， 给平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴后再用 DNA 连接酶进行连接 用衔接物连接平末端DNA分子 平末端DNA分子： c. 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点， 上构建限制性核酸内切酶酶切位点 ， 经酶切后产生 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接 DNA
源自文库植物基因工程
常用的工具酶性质及功能
工具酶名称 限制性内切核酸酶 Restriction endonucleases DNA连接酶 连接酶 DNA ligase DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 DNA polymerase I 多核苷酸激酶 DNA polymerase kinease 反转录酶 Reverse transcriptase DNA末端转移酶 末端转移酶 DNA terminal transferase 降解酶 S1 nuclease S1 Taq DNA 聚合酶 Taq DNA polymerase 主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
植物基因工程
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
植物基因工程
核酸合成酶类
核酸修饰酶类
用于核酸操作的常用工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
植物基因工程
植物基因工程
Replication
植物基因工程
分子克隆操作过程：
克隆目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割 和连接，制成重组DNA→导入宿主细胞→筛选、鉴定 →扩增和表达。
植物基因工程
工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、 聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来， 需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需 要 DNA 聚合酶（polymerase）等。 因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
植物基因工程
位点偏爱（ 位点偏爱（site preference） ） 某些限制性内切酶对不同位置的 同一个识别序列表现出不同的切割 效率。 效率。
植物基因工程
第二节 DNA连接酶 DNA Ligase 连接酶
植物基因工程
一、DNA连接酶性质 连接酶性质
定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的 DNA上裂口两侧 定义：催化DNA上裂口两侧(相邻) 3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯 羟基和5 键，使断开的DNA裂口连接起来 使断开的DNA 功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、 功能：具有修复单链或双链的能力, DNA重组、 重组 复制和损伤后的修复中都起关键作用。 复制和损伤后的修复中都起关键作用。
植物基因工程
第一节 分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀” 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。 EcoRI, DNA双链切开 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶” 分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平 DNA连接酶 连接酶——