去除内毒素的方法总结

内毒素的去除是做蛋白表达时至关重要的一步,同时也是非常棘手的问题，本文就针对内毒素的去除方法以及各方法的注意事项进行了归纳总结。

一、什么是内毒素？
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。

内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。

所有能引起热原反应的物质称为热原。

药品中的热原主要是细菌内毒素。

一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。

二、细菌内毒素的理化性质
•耐热性：彻底灭活需250℃高温干烤一小时
•水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。

•不挥发性
•被吸附性：可被活性碳吸附
•被酸碱破坏： 0.1M HCl或0.1M NaOH 浸泡4小时
•被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏
三、器皿中内毒素的去除:
a.干热法
•适用对象：耐热物品如玻璃制品、金属制品等生产过程中所用的容器
•处理方法： 180℃3～ 4h 或 250℃ 30min～ 2h
•注意事项：
• 1.在干烤前，被加热的玻璃器皿上最好不要有水珠，否则可能会使玻璃器皿损坏。

• 2.烘烤结束后，玻璃器皿不要马上从电热烘箱中拿出，要等温度适度降低之后才可以拿出，以免因温差太大而造成玻璃器皿损坏。

• 3.器皿上不能含有纸质或塑料制品，以免烘烤时燃烧或熔化。

b.化学降解法
•适用对象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素。

•处理方法：常用3～5％双氧水、重铬酸钾硫酸清洁液（重铬酸钾∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。

一般处理4h以上。

•注意事项：佩戴防护用具，防止皮肤直接接触。

四、溶液中内毒素的去除
但是，各种去内毒素的方法不是孤立的，可以相互结合使用。

比如，如果液相分离法得
到的蛋白内毒素水平未达标，可以接着利用分子筛法进一步去除内毒素。

五、作为目前去内毒素常用的方法，液相分离法的注意事项值得我们重视
1.液相分离方法应用于蛋白纯化中内毒素的去除
a.目的蛋白上样后，用预冷的基础溶液+1% Triton X-114缓慢淋洗柱子，直至A280数值稳定不变；
b.用预冷的去内毒素基础溶液淋洗柱子，直至A280数值达到基线，稳定不变；
c.用各梯度去内毒素的洗脱液洗脱，收集各洗脱液于去内毒素的收集管中。

d.此方法适用广泛，如我们常用Ni柱、GST柱和离子交换柱等纯化。

e.纯化过程应尽量在洁净的环境下进行，纯化时间不宜过长。

f.所用的吸管、枪头等器材应为经去内毒素处理的。

2.液相分离法应用于大量样品中内毒素的去除
a.在大量蛋白样品中加入终浓度为 1% 的Triton X-114 ，充分混匀，冰浴 5min ，使之成为一相；
b.升温超过其浊点 21 ℃，37 ℃孵育，观察分层情况；
c.待溶液中出现明显分层后，室温下 12000r/min ，离心5min ，吸取上清液；
d.为达到较好的去除效果，可以重复 2 次。

e.如果样品内毒素含量较高，可以提高Triton X-114浓度至2%。

f.如果升温至37 ℃后，分层不明显或比较慢，可以升温至56 ℃孵育。

g.本方法不适用于去除膜蛋白中的内毒素
六、去内毒素试剂的配置
a.在溶解前将固体试剂用180 ℃烘4-5h，以去除试剂中的水分和内毒素。

此法适用于试剂的熔点高于180 ℃。

若试剂熔点低于180 ℃，常使用80 ℃烘过夜。

b. 去内毒素的水溶解烘过的试剂，定容，调节pH。

c.检测所配置试剂的内毒素含量是否达标，通常为0.01EU/ml。

常见的熔点低于180 ℃或高温分解的试剂：
1.Tris （168-172℃）
2.尿素（ 132.7℃）
3. 咪唑（89-91 ℃）
4.甘油（ 17.8℃）
5.EDTA （150 ℃脱羟基）
6.SDS（165 ℃）
7.肌氨酸钠（ 120℃）
常见的需烘烤后才加入的试剂：（危险品，挥发性气味）
1.DTT（42-43 ℃）
2.β-巯基乙醇（<-100 ℃）。