禽巴氏杆菌病病原的分离与鉴定(以发表)

禽巴氏杆菌病病原的分离与鉴定

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（***动物疫病预防控制中心***）

禽巴氏杆菌病又叫禽霍乱和禽出血性败血症，是禽类的一种常见接触性败血性传染病，各种类型的禽均可感染并导致死亡。其特征表现为急性败血过程，发病率和死亡率都很高。低毒感染或急性发病之后，可出现慢性的、局部性的疾病。

（一）、病原

1、形态染色

禽巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的，多杀性巴氏杆菌为卵圆形的短小杆菌，少数近于球形，长约0.6~2.5 um（微米），宽约0.2~0.4 um，无鞭毛，不能运动，不形成芽胞。革兰氏染色阴性，多呈单个或成对存在。在组织，血液和新分离培养物中的菌体用美蓝、瑞氏、姬姆萨氏法染色均可着色，菌体呈明显的俩极着色，中间部分着色较浅，很像许多并列的两个球菌，所以又叫两极杆菌。血清型菌株有荚膜，用印度墨汁等染料染色时，可以见到清晰的荚膜。人工培养后及弱毒株，荚膜不明显或消失。

2、培养特征

巴氏杆菌为需氧兼性厌氧菌。在普通培养基上可生长，37℃培养18~24h （小时），可见灰白色，半透明，光滑，湿润，隆起，边缘整齐的露滴状小菌落，直径约1~2 mm（毫米）。本菌在鲜血琼脂，血清琼脂或马丁琼脂平皿上培养，生长良好，不溶血。在肉汤中培养时，初期呈均匀混浊，24h后上清清亮，管底有灰白色絮状沉淀，轻摇时呈絮状上升。新分离的细菌接种到马丁琼脂平皿上，通过45°折光观察，可见菌落有荧光，呈橘红色带金光，边缘有乳白色光带，结构细致，边缘整齐，称为Fo型菌落，对鸡等禽致病

力强；另一类菌落呈蓝绿色而带金光，边缘有红黄色光带，称为Fg型菌落，对鸡等禽致病力较弱。

该菌可利用果糖，甘露糖，蔗糖，产酸不产气；不能利用肌醇乳糖，靛基质，过氧化氢酶，氧化酶和硝酸盐还原阳性，尿素酶阴性，不液化明胶，在麦康凯培养基上不生长，普通琼脂上发育不良或不发育。

3、种类

多杀性巴氏杆菌的抗原结构比较复杂，分类方法有很多种，Garter在1955年用间接血凝试验根据细菌荚膜将其分为A、B、D、E四个型。Rimler 于1987年又发现一种新的荚膜血清型F，[17]Namioka用盐酸除去荚膜做交叉凝集试验，将该菌分为1~12个菌体血清型。至此，本菌的血清型可以用荚膜血清型和菌体血清型合并表示，以阿拉伯数字表示菌体抗原，大写英文字母表示荚膜抗原，如5：A。禽巴氏杆菌多属A型，少数见于D型。经我国学者对禽巴氏杆菌分型研究表明，我国流行的禽源巴氏杆菌大部分均为5：A、8：A及9：A。

多杀性巴氏杆菌的荚膜与其毒力有关，有致病力的菌株如果失去产生荚膜的能力，可导致其毒力的丢失。已有研究表明多杀性巴氏杆菌在体内繁殖可以产生毒素，内毒素是其主要的毒力因子，引发病理过程。

（二）、禽巴氏杆菌的分离与鉴定

（1）、病料采集：

无菌操作采取死亡鸡肝脏、脾脏、心脏,采病料时用烧红的刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心脏内取样。

（2）、涂片镜检：

将肝触片和心血涂片，滴加几滴甲醇，作用2~3 min,自然干燥，然后分别进行革兰氏染色和美兰染色，镜检。

（3）、禽巴氏杆菌分离与纯化：

无菌取急性死亡的鸡的心血、肝分别接种血液琼脂平板、麦康凯培养基

等培养基上，37℃培养24ｈ。观察培养基变化情况并涂片镜检。然后再从血平板上挑单个菌落接种到营养肉汤、厌气肉肝汤观察其生长特性。最后从血平板上挑取疑为禽巴氏杆菌的单个菌落，在含4%血清和0.1%裂解全血的马丁平板上划线，37℃培养18h备用。

（4）、禽巴氏杆菌的纯度检验：

将菌株画线接种于鲜血琼脂培养基，37℃培养18~24 h后观察。菌落形态一致的菌落,经涂片，革兰氏染色，镜检。

（5）、禽巴氏杆菌的生化试验：

将分离的细菌接种到血液琼脂平板上，37℃培养18~24ｈ，挑取单取个菌落到乳糖、蔗糖、果糖、山梨醇、尿素酶、葡萄糖、麦芽糖的微量生化反应管中，37℃培养24ｈ后，观察结果。

注：附禽巴氏杆菌的生化试验鉴定标准表。

表二：巴氏杆菌的生化试验鉴定标准表[19]

试剂乳

糖

半

乳

糖

蔗

糖

水

样

苷

果

糖

甘

油

山

梨

醇

甘

露

醇

尿

素

酶

菊

糖

葡

萄

糖

麦

芽

糖

鼠

李

糖

明

胶

反

应

-U + + - + +U +U + - - + - -U - “+”表示反应，“-”表示无反应，“U”表示通常，“V”表示不定。

（6）、禽巴氏杆菌致病试验：

将分离的细菌接种营养肉汤，37℃培养18~24ｈ后，取5只小白鼠腹腔注射，每只0.1ml，另外取5只按同剂量腹腔注射生理盐水做对照。观察，有死亡小鼠则解剖取心血涂片镜检。

（三）、结果

（1）、涂片镜检：

可见菌体两极浓染，中间部分着色较浅，革兰氏染色为革兰氏阴性小杆

菌。

（2）、禽巴氏杆菌分离：

血液琼脂平板上生长出稍突、白色、半透明、奶油状、不溶血的菌落，营养肉汤和厌气肉肝汤混浊，麦康凯培养基上不生长。镜检为革兰氏阴性、两极着色的短小杆菌，多数单个存在。在含0.1%裂解全血和4%血清马丁琼脂平板上生长的菌落，对光肉眼观察菌落呈微兰色。在低倍显微镜下，以45℃折光检查，菌落为桔红色荧光。在普通肉汤中能生长。在含4%血清的马丁肉汤中生长良好，呈均匀混浊，少数菌株在管底有微量沉淀。

（3）、禽巴氏杆菌的纯度检验：

划线平板上菌落生长分布均匀,有一定数量单个菌落,且菌落形态一致。染色镜检见革兰氏阴性小杆菌或球杆菌。

（4）、禽巴氏杆菌生化实验：

禽巴氏杆菌生化实验的结果如表三所示。根据表二判断，结果符合巴氏杆菌生化特性。

表三：禽巴氏杆菌生化实验

试剂乳糖蔗糖果糖山梨醇尿素酶葡萄糖麦芽糖结果- + + + - + - （5）、禽巴氏杆菌致病性实验：

注射细菌的小鼠24小时内全部死亡。对照组小鼠无不良反应。死亡小鼠涂片镜检见两极浓染，中间部分着色较浅的小杆菌。

（四）、分析

根据分离菌涂片镜检的结果、血平板上形成的菌落形态、培养特性、麦康凯培养基上不生长、生化试验结果、动物攻毒试验,可以确诊该分离菌为鸡多杀性巴氏杆菌。

（五）、小结

细菌的分离与鉴定中，根据分离菌涂片镜检的结果、血平板上形成的菌