蛋白质组学在肿瘤研究和临床应用中的意义

蛋白质组学在肿瘤研究和临床应用中的意义

李春海

中国抗癌协会、军事医学科学院

在人类基因组计划的实施和完成后，研究重点已转移到基因的功能上，从而进入基因组时代。而生物功能主要执行者是蛋白质，1994年澳大利亚Macquarie大学的wilkius 和williams首先提出蛋白质组学（Proteome）的概念，Proteome一词是蛋白质（protein）与基因组学（genome）两个词的组合，指的是一种基因组所表达的全部蛋白质，既包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质，而蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学。其主要内容包括结构蛋白质组和功能蛋白组学，它是从细胞整体水平进行蛋白质特性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对疾病过程、细胞生理、生化特征和调控网络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学及其技术正在逐步成为生物学、医学及药物学等的理论依据和研究手段。

一、 肿瘤标志筛查策略

1、肿瘤检查传统方法

大多数肿瘤早期无明显症状，因此对肿瘤高危人群进行筛查（Screening）尤为主要，肿瘤筛查是对一般健康的无症状的人群，用适当的指标对其进行检查，从而发现一些指标阳性的人群，并对这些人群或高危人群进一步进行临床检查和随访观察，从而达到早期发现、早期诊断、早期治疗的目的。以往，早期的肿瘤筛查多采用临床上常用检查方法：图像诊断（CT、MRT、PET）化学诊断，（血液学和免疫学）及病理学（细胞学、组织学）如细胞病理学检查；X线检查及各种内窥镜检查；和实验室生化检查，如甲胎蛋白用于肝癌的筛查，前列腺特异抗原用于前列腺癌的筛查，癌胚抗原用于大肠癌的筛查等。其中许多检查目前仍在应用，并取得了良好的效果。此外还有一些经典检查方法如瑞典的一项调查结果表明应用X线以及乳腺自查方法对乳腺癌进行筛查使乳腺癌病死率下降44%[2]。应用巴氏涂片对人群进行宫颈癌筛查使美国宫颈癌死亡率下降70%。

但上述方法应用于人群筛查仍存在很多缺点，主要是有一些属于损伤性检查。筛查方法操作过于复杂、对人体的侵害性较大，人群依从性差及成本高，而有一些肿瘤标志虽然可应用于人群的肿瘤筛查。如PSA用于前列腺癌筛查虽然特异性好，但敏感性差，导致部分患者被漏查；甲胎蛋白用于肝癌筛查由于特异性较差，阳性预测值较低，出现假阳性。因此，肿瘤筛查要选择适当的方法，提高其可操作性及人群依从性，选择高度特异性的标志物，或多种标志物联合检测来提高敏感性和特异性。

2、肿瘤发生发展过程与肿瘤标志的筛选

肿瘤发生过程是一种多基因多阶段多因子的部复杂过程,是癌基因激活和抑癌基因失活的结果.而从组织增生产生原位癌变的过程中，肿瘤发生、启动、增生、癌前病变到成癌过程中除了基因水平的变化外，而在分子水平还有不同的功能性蛋白的参与,这就为寻找与癌变过程有关的相对特异肿瘤标志物提供了线索。

肿瘤进展阶段是处于癌变与成癌之间的一个过渡阶段,早期发生突变并表达的基因在此阶段表达量进一步增强,为侵袭转移提供潜在的动力。转移也是多步骤复杂连续的过程，与转移有关的特殊基因受到激活，并有多种蛋白水解酶的参与。总之，肿瘤在发生发展和转移的过程中,每演进一步在分子水平就有不同的功能性蛋白参与,并且很可能在各个环节相互协调共同表达。因此从肿瘤发生、发展、演进过程的筛选与肿瘤相关的起关键性调控作用的标志,无论从理论上还是从实际的研究来说都是可能的。

最初在寻找分子标志的时候,仅仅局限与某些特定的突变型蛋白(如C-erB-2、p180、雌激素受体等)与表达增强的突变型的蛋白（P53, CycliD 1[3]等）,它们不但可以作为早期发现肿瘤的标志,而且可以作为肿瘤进展程度的标志.但是随肿瘤恶化程度的增加，多种基因发生突变,已很难从单个蛋白的变化对肿瘤进行诊断分型以及预后判断。因为单个蛋白仅仅是肿瘤恶性发展过程中单一因子的变化，并不能真正反映出癌变过程多种因子的复杂变化.蛋白质组学技术能对不同肿瘤的蛋白表达谱进行全面的分析，这样可筛选出多种肿瘤标志为肿瘤标志物的联合检测提供更多依据。

3、蛋白组学在肿瘤标志筛选中作用

目前仅靠原有传统免疫检测技术：如免疫荧光、免疫酶标、免疫印迹以及分子原位杂交等技术,检测癌组织和细胞中的微量表达的组织特异性抗原\细胞系抗原或糖链异常合成的糖蛋白以及肿瘤相关的癌基因、抑癌基因等，但是这不能满足目前临床需要。为了寻找和筛选新的肿瘤相关标志物，需应用先进分子生物学技术,尤其是近年来迅速发展的基因组学,蛋白质学技术及生物信息学。以PCR技术为基础的微卫星技术和单核苷酸多态性(SNP)的测定，使人们可以通过特定引物从患者的体液或肿瘤样品中直接扩增出微量表达的基因,它比传统的PCR技术测定数效率高、目的性强、定位精度高和易于进行自动化分析等优点.而基因芯片与微卫星技术和SNP结合,为高通量、自动化寻找肿瘤相关基因标志提供新的技术途径。

而PCR技术和基因芯片都是通过基因型寻找新的肿瘤基因标志,但不是从具有生物功能的蛋白质进行分析。虽然从mRNA水平能够快速研究相应转录子的表达谱，但在翻译的过程中要进行磷酸化、基化、乙酰化、糖基化等修饰，并不能了解肿瘤发生发展过程中蛋白表达质与量的变化,体内mRNA与相应蛋白的表达水平并没有直接的关系。而细胞信号转导途径中各信号蛋白之间的交流与细胞是否处于休眠静息、分裂增殖、分化，凋亡还是转移等生命活动状态密切有关,而肿瘤的生长依赖多种蛋白质分子，如各种生长因子和酶，而这些蛋白质分子与肿瘤的发生发展有密切关系，因而都可能成为潜在的肿瘤标志。

但是传统的检测方法往往一次只能检测一种肿瘤标志物，而利用单个肿瘤标志物诊断肿瘤，其特异性和敏感性都不够理想。蛋白质组学技术可以高通量快速的筛选肿瘤不同发生阶段基因表达的各种蛋白质，尤其是组织与体液中所含有的与肿瘤相关的低丰度蛋白，从而发现大量有诊断价值的蛋白标志分子，而这些蛋白能够为肿瘤治疗提供新的靶点,为早期诊断提供有效肿瘤标志。联合多种标志物进行肿瘤的筛查将有望提高筛查的特异性与敏感性。

二、 蛋白质组学研究方法

从蛋白质组学分析表明肿瘤是一种蛋白质缺陷病，在其发生过程中有许多蛋白质发生异常变化，而这种变化不仅有蛋白量表达的变化，还有蛋白翻译后加工上的改变，从而导致肿瘤组织表达的蛋白图谱（Protein profile）的变化，所以应用蛋白组学技术检测蛋白图谱的变化可以预测肿瘤发生的变化。目前应用于蛋白组学研究的主要技术有：双向凝胶电泳（Two-Dimensional gel Electrophoresis， 2-DE），质谱技术（Mass Spectrometry ，MS）。微阵列技术（Microarry）和生物信息技术（Bio-Informcnation，BI）。

1、双向凝胶电泳

1）原理

双向凝胶电泳技术主要用于分离肿瘤组织样品或体液中的蛋白质，其基本原理首先根据蛋白质等电点和分子量的差异中进行第二向分离。自Ｏ′Ｆａｒｅｌｌ等提出双向凝胶电泳以来，虽有二十多年的历史，直至目前在蛋白质组研究中仍具有不可替代的地位，因为其具有高分辨率和同时具备微量分析和制备样品的性能，仍应用于膀胱癌、肾癌、甲状腺癌症相关肿瘤标志的筛选和研究中。

2）应用

Ｃｅｌｉｓ［５］等采用双向电泳在膀胱癌病人的尿液中发现了４种蛋白质、银屑素、银屑病相关脂肪酸结合蛋白５、凝胶溶素片段和前列腺素Ｄ２合成酶．银屑素是一种高钙结合蛋白质，主要由鳞状上皮细胞表达，在银屑病角质细胞中表达增高，仅发现于膀胱鳞状细胞癌病人（squamous cell carcinomas，SCC）的组织及尿液中，而在纯移形细胞癌（transitional cell carcinomas，TCC）中难以检测其表达，因此可将银屑素作为膀胱鳞状细胞癌病人的预后标志。而在肾细胞癌的研究中发现血浆谷胱苷肽过氧化物酶、锰弱氧化物歧化酶两种单体出现在正常的组织中，而锰弱氧化物歧化酶只出现在肿瘤组织中，所以可将两种蛋白作为肾细胞癌的肿瘤标志物[6]。LIN[7]等双电泳分析了SW579、CGTH W-1、CGTH W-3、RO82 W-1四株甲状腺癌细胞系，发现CGTH W-1、CGTH W-3、RO82 W-1细胞系中有特异的蛋白质，而这些点可以作为甲状腺的肿瘤标志物。

3）局限性

应用在2-DE技术对病变组织所得分析时，必须慎重，因为一般并不清楚肿瘤进展过程中蛋白质表达的变化是偶然发生的，还是由于来自不同患者的样品之间差异造成的。此外，由于双向凝胶技术本身的问题：如手工操作、难以掌握：很难分离到高级性的蛋白质；由于第二向SDS PAGE的限制，对于低分子量和高分子量的蛋白及样品