核磁共振谱图简介

核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
脉冲付里 叶变换超导 核磁共振谱 仪
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
脉冲付里 叶变换超导 核磁共振谱 仪
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
脉冲付里叶变换 核磁共振 谱仪
Magnet Probe Console Computer
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
超导磁体
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
脉冲谱仪普遍采用单线圈探头，发射与接收由同一线圈完成
匀场系统 (The Shim System)
低温匀场系统 室温匀场系统 the on-axis (spinning) shims (z,z2,z3,z4..) the off-axis (non-spinning) shims (x,y,xy...)
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
对磁体的要求：高稳定性
磁场变化的原因：磁体的老化；附近有金属物体移动；温 度的波动 解决方法：监视 2H 锁信号的共振频率（由氘代溶剂提供 ）
场频联锁：
磁场变化 共振频率变化 总磁场保持不变 产生校正电流 产生补偿磁场
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
探头
功能：放置样品管，发 射射频脉冲，接收核磁 信号； 组成：射频线圈及调谐 电路；梯度磁场线圈； 热电偶，加热器件，传 送恒温气流的杜瓦管道 ；样品管进出用的气流 通道
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
接收器
前置放大器：由于核磁信号很弱，前置放大器总 是尽量靠近探头，其性能决定了仪器能达到的信噪 比 相敏检波：从射频信号中检出低频的核磁信号 （相当于旋转坐标系中的信号），并完成正交检波 模数转换器：或称 ADC ，完成模拟信号的数字化 ，一般谱仪考虑到转换速度和动态范围，配置的为 16bit ADC ，其动态范围为 -28 到 28-1 即 -32,768 到 32,767
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
C 卫星线 指与 13C 相耦合的质子产生的 谱线
13
旋转边带 样品旋 转时由于磁场不够均 匀而在强峰两边产生 的弱峰，与主峰的距 离为旋转速度的倍数
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
氯仿 / 氘代丙酮的 NMR 谱 (Hump test)
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
对磁体的要求
高磁场强度 高均匀性 高稳定性
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
对磁体的要求：高磁场强度
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
高场谱仪分辨率的提高
900 MHz
Oestradiol-acetate
1450
1400
1350
1300
1250
1200
Fra Baidu bibliotek
1150
1100
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
核磁 共振原 理及 其在 生物学中 的应 用
第七章 仪器和 实验方法 § 7.1 — § 7.3
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
样品 的准备
样品的体积 现代超导谱仪一般 使用 5mm 直径样品 管，溶液体积 0.5ml-0.7ml ，至少 0.4ml 。早期作 13 C-NMR 谱使用 10mm 直径样品管，溶液 体积 1.5-2ml 。
缓冲体系的成份首先要保证蛋白质的 稳定及高溶解度 ，蛋白质的浓度通 常要求有数 mM 其次要考虑缓冲液中其他成份对蛋白 质谱图的干扰，在这方面磷酸盐缓 冲液最好，其他的如 Tris 或乙酸等 有机成份由于本身也有 CH 质子， 其化学位移与蛋白质中的 CH 相近 ，因而有干扰，特别是缓冲液浓度 较蛋白质高出很多时。如果作同核 谱，最好能用氘代的 Tris 和乙酸等
600 MHz
950
900
850
800
750
Hz
400 MHz
650
600
550
Hz
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
对磁体的要求：高均匀性
在 100MHz 的谱仪中，假若磁场变化 10-9 ，就会使频率变化 0.1Hz ，所失去的分辨率就等于或超过自然线宽 影响磁场均匀性的原因： 磁体设计方案；探头形状与材料；样 品管厚度不均匀，同心度不好；样品溶解不均匀，有悬浮颗粒； 磁体附近有铁磁性物体 解决方法：在探头周围放置多组线圈，称为匀场线圈，通上适当 大小的电流，产生校正磁场，提高总磁场的空间均匀度 低温匀场线圈：同主线圈一起浸在液氦中，平常电流不可调节 室温匀场线圈：工作在室温，有二三十组线圈，每换一个样品均 需调节其电流大小（称为匀场 ） 要进一步提高分辨率，可以让样品管绕其自身的轴旋转，以平 均掉垂直于转轴平面中的磁场梯度。样品旋转会伴随旋转边带的 产生，转速不同，边带的位置也不同。样品旋转不能太快，否则 会产生涡流。通常旋转速度为 20-50Hz ，一般边带小于主峰的 1-
锁场系统 (The lock-system)
氘锁系统 保证磁场稳定
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
脉冲发生器
频率综合器：产生所需频率的射频电流 脉冲编程器：控制脉冲的时序，长度， 幅度，相位甚至形状 射频放大器：产生足够的功率（几十至 几百 W ） 通常一台谱仪有若干射频通道，分别工 作在不同的核的共振频率上，在实验中可 以同时施加作用于不同核的射频脉冲
Hz
Current Data Parameters NAME txioestradiol EXPNO 3 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 20010126 Time 16.50 INSTRUM spect PROBHD 5 mm TXI 13C Z PULPROG zg TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 4 DS 0 SWH 7440.476 Hz FIDRES 0.113533 Hz AQ 4.4040694 sec RG 180 DW 67.200 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 3.00000000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 10.00 usec PL1 -4.00 dB SFO1 900.0236581 MHz F2 - Processing parameters SI 65536 SF 900.0200000 MHz WDW GM SSB 0 LB -0.30 Hz GB 0.3 PC 4.00
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
蛋白 质 NMR 研究的溶液条件
选择的 pH 值尽量在偏酸性如 pH 3~5 ，也 可以稍为高一些，但尽量不要大于 7 。这 是因为蛋白质中的酰胺质子 NH 在 pH 3~5 之间与水的交换最慢，在其他 pH 特别是 7 以上交换加快，导致 NH 的信号减弱甚 至消失，而 NH 的信息对于蛋白质主链乃 至侧链谱峰的认证都十分重要
离心 ：样品（特别是生物大分子）溶解后，应该离心 除去可能的微小颗粒，以免影响匀场，降低分辨率 除氧 ：在高分辨结构和弛豫研究中除氧是极为重要的 （特别是小分子），溶解在溶液中的分子氧具有顺磁 性，它会极大的减少弛豫时间，必须将氧除去。除氧 的方法通常有两种，一种叫冰冻－抽真空－融化 : 即 把样品放在 NMR 样品管内冰冻，然后抽真空，融化， 重复上述过程四次，最后在真空中将管口封住。另一 种方法是将氮气或氦气，氩气强迫通过整个样品体积 把氧赶走
核磁共 振谱 仪的 主要指 标
灵敏度 (sen sitiv ity)
灵敏度是指谱仪能够测量出弱信号的能力。核磁共振谱 仪的灵敏度不仅受到放大器增益的限制，而且受到电子 线路中随机噪声的限制，如果弱信号和噪声振幅大小相 同，则弱信号就不能检测出来。 灵敏度以信噪比表示 S/N ＝ 2.5H/h 其中 H 是信号高度， h 是噪声振幅的峰－峰值。 h 值除 以 2.5 的原因是：按照噪声理论，噪声振幅的峰值是无 意义的，只有均方根噪声才有意义，二者之间的转化因 子在核磁共振中选为 2.5
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
1
H 灵敏度
老式的谱仪用 1%(v/v) 的乙基苯 / 四氯化碳作为标样，测 定某些指定谱线的信噪比，大致在 20-300 或更高 现代的 FT 谱仪用 0.1%(v/v) 的乙基苯 / 氘代氯仿作为标样 ，同样测定某些指定谱线的信噪比
13
C 灵敏度
老式的谱仪用 90% 的乙基苯 / 四氯化碳作为标样，测定某 些指定谱线的信噪比，得到的信噪比和质子一般同数量级 现代的 FT 谱仪用 10%(v/v) 的乙基苯 / 氘代氯仿 (1H 去耦 ) 或 ASTM(40% p-Dioxane/60% 氘代苯 ) (1H 不去耦 ) 作为标 样，同样测定某些指定谱线的信噪比
作异核谱时影响相对小一些，但其他 有机成份也应控制在数十 mM 内。 无机盐浓度不宜大于数百 mM ，否 则会影响核磁谱仪探头的调谐。在 样品溶液中不能有重金属离子污染 ，因有顺磁性会降低核磁信号的强 度和分辨率，必要时可在透析液中 加 EDTA 等除去。
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
样品的处理
在样品 管中溶液 的深度由两 个因子决定 ，样品若超过一 定高度，超 过部分将 会接收不到发射 线圈发射的 射频造成 浪费；若太低则 样品与空气 磁化率的 不同造成界面磁 化率突变会 影响样品 中磁场的均匀性
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
样品 的浓度
由于核磁共振实验固有的低灵敏度，所以它需 要比一般红外、紫外实验更大的样品量，这往 往成为核磁共振技术在生物学中应用的一个关 键问题 对于质子磁共振波谱，样品浓度一般在 10-2-104 M 。在 FT 谱仪中通过多次波谱累加可以降低 对最低浓度的要求，只要时间足够，在原则上 对于一个分子量 20000 的蛋白质，可以得到 13mg 样品的 1H 核磁共振波谱
溶剂 的选择
一个理想的溶剂必须满足以下的条件 ： 1. 样品在其中有高溶解度； 2. 在我们所感兴趣的波谱范围内没 有溶剂峰； 3. 在做变温实验的温度范围内保持 液体状态 通常使用一些氘代溶剂 减少溶剂峰的干扰
锁场
采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用 氘代氯仿是一个很理想的溶剂，它既适 合于 1H ，也适合于 13C ，在整个质子谱 范围内透明，再加上化学性质惰性，便 宜，所以是常用的溶剂 H2O 是生物分子最适宜的溶剂 (90%H2O,10%D2O)
样品的 浓度
对于 13C 谱来说，由于 13C 的低灵敏度 ，样品浓度的最低限度是 10-2M 。对 于一个分子量为 20000 的蛋白质， 使用 10mm 直径的样品管，样品体 积是 1.5ml ，则需要大约 300mg 的 样品 天然小蛋白质 同位素标记的蛋白质 5mM >1mM
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
氯仿 / 氘代丙酮的 NMR 谱
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
核磁共 振谱 仪的 主要指 标
线型 (l inesh ape)
仅仅最小线宽还不足以表征分辨率，特别是所观察的两个 峰高度相差甚大时，这时分辨率在很大程度上受到强峰接 近基线处形状的影响。这时还要进行一种波峰 检验 (Hump test) 老式的谱仪用 10%(v/v) 的氯仿 / 四氯化碳作为标样，测定 氯仿主峰的 0.5% 处即 13C 卫星线高度处谱线的宽度，大致 在 7-15Hz 现代的 FT 谱仪用 1-3% 氯仿 / 氘代丙酮作为标样，测定氯 仿主峰的 0.55% 及 0.11% 处谱线的宽度
核磁共振基本原理 8 讲 吴季辉
核磁共 振谱 仪的 主要指 标
分辨率 (res oluti on)
谱仪的分辨率被定义为能区分两个接近的共振峰的能力 ，和一般光谱仪不一样它不是由能区分的最小频率间距 -υ2 表示，因为 -υ2 与仪器的频率有关， 1 1 250MHz 的谱仪可以区分的频率间距自然大于 60MHz 谱 仪。核磁共振谱仪的分辨率受到谱线宽度的限制，谱线 不是无限窄的，它有一定的宽度，用共振峰半高处的宽 度表示。表观线宽不仅取决于弛豫过程，而且取决于仪 器本身 老式的谱仪用 10%(v/v) 的邻二氟苯 / 四氯化碳作为标样 ，测定某条指定的谱线的半高宽，大致在 0.1-0.5Hz 现代的 FT 谱仪用 1-3% 氯仿 / 氘代丙酮作为标样，测定