第八章抗生素药物的分析

第八章抗生素药物的分析
£第一节概述
抗生素的概念：
具有抑制或杀灭微生物的一类物质。

抗生素的特征：
生物体在生命活动过程中合成的次级代谢产物O 性质不稳定，易降解、聚合
纯度一般较低
临床上会引起不良反应
临床应用广泛，影响大
抗生素药品质量研究的项目:
性状及鉴别试验，含量测定或效价测定，酸碱度直度，水分或干燥失重，安全试验
■（尊希養裡5,热原，降压物质，无菌。

其他检查：组分、杂质、晶型、比旋度、灰分、重金属、熔点等。

抗生素药品分析常用的方法：
物理方法:旋光法、紫外、红外、色谱等
化学方法（专属性不强）:功能团反应，鉴别和含量
含量测
的测定。

容量分析
定）和碘量法。

生物学方法：酶反应、微生物法测定效价
L第二节抗生素效价微生物检定法
■、微生物检定法定义：
是利用微生物发育时对某些物质的特殊依赖性，按这些物质对微生物生长的影响，对他们作出定量鉴定的方法。

微生物检定法可分为三类：稀释法((Hlute method)、比浊法(turbid compare method)、琼脂扩散法(diffuse method)。

与化学方法相比: 优点：1、原理与医疗要求基本一致
2、对微生物作用直接反映其抗菌活性
缺点：1、结果是总效价，无法区分多组分
2、时间长，有一定误差，操作繁杂
:、抗生素标准效价(potency)单位
牛津单位:抑制50毫升肉汤培养基中金黄色葡萄球菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位.
一个牛津单位相当于0・6ug的青霉素钠盐所具有的抗生活力，lmg青霉素G钠盐含有1667个牛津单位，(IU)
(一)稀释单位(u/ml, u/mg)
将lmg
对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为lmg 抗生素中可含有的单位。

（二）重量单位（u/mg）
以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作为抗生素的单位。

称重量单位… 如一个链霉素碱卒位的重量为1微克，一个青霉素G钠盐
6微克。

同一种抗生素的各
的单位的重量为0
种盐的校价可根据其分子量与标准盐类进行换算而得。

青霉素G 钾盐的理论效价(U/mg)二
青霉素G 钠盐的理论效价x 青霉素G 钠盐的分子量
青霉素G 钾盐的分子量
1类似重量单位： 1667x356.37 372.48
= 1593 (U/mg)
以抗生素盐类纯品的重量为单位。

包括无生物活性的酸根和金属离子。

2重量折算单位
以与原始的生物活性相当的纯抗生素实际重量为一个单位，
3特定单位
以特定抗生素某一批产品的某一重量为一个单位，经
有关国家权威机构认可而定. 效价测定的方法：
一、稀释法(dilute method)
二、比浊法(turbid compare method)
三、琼脂扩散法(diffuse method)
2 J 标准液或被检液12345液体培养基u …… 空白
稀释法
理—用液体培养基逐
, 在各
管中加入等量的试验菌液，进行培养, 观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。

5ml（或2ml〉_ 一•
■ X=(T/S)*C
■X样品效价(U/ml)
■T检品液最大稀释倍数■ S标准品液最大稀释倍数■ C标准品液效价(U/ml)
细菌被抑制+:细菌生长
X二(T/S)*C= (16/32) *40=20 (U/ml)
1＞试验菌生长完全抑制生长50%抑制指示2
剂变色电位差的改变菌种的溶血现象等、
3
、
4
原理：将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养（约3-4h）,测量培养基浊度，其浊度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系, 在一定的范围内符合比耳定律。

细菌数、细菌群体质量又直接受抗生素效价的影响。

耳.影响因素：
鼻一、影响比浊法的物理因素
1、散射现象
2、菌液浓度:
3、细菌体大小的变化
二、培养基：在没有外加抑制剂的情况下，菌体
温度、通气等
的生长受培养基的成分、酸Array
条件影响。

一般的试验菌是金黄色葡萄球菌，pH在
6.8-7・8。

三、培养：温度、振摇。

一般培养时间3小时，
可缩短为2小时。

I操作流程如图:
基本要点：
乃. 1培养条件的控制：试管规格均一水浴
*-------- 均匀，试管按拉丁方排列。

2细菌生长误差的控制：
3测量时间的控制：各管应先充分混匀，
将菌液移入比色皿后静止2分钟后测定。

1=
图3・13细菌比浊法、大试■竝丁方排列图
为电动携拌机
m?
三、琼脂扩散法(diffuse method) 电管碟法
*管碟法原理：
一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透 明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面 积或直径成正比。

在同样条件下将已知效价的标准品 溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进 行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素 时，标准品溶液和供试品溶液.对一定试验菌所得的 剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。

根据
测豔蠶誡慕法及―列量法。

抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成
!1 II =J
■已
抑菌圈的形成
T-扩散时间（h）、. M-抗
生素在管中的量（U・卩
r—抑菌圈的半径（mm ）
L 一管的高度（mm）
H—培养基的厚度（mm）
C-最低抑菌浓度（U/ml ）
D—扩散系数（mm2/h ）
3-8抗生素在管嚟法中呈球面扩散示意图
ogAf =(l/921DT)r2 +logCx4^D7H) M:抗生素在管中的量
■ D：扩散系数
■ T：扩散时间■ H：培养基厚度
■ C：
=9.21DT(log M-logCx 4TT DTH)
D 的响因
抗生素本身事构、分子量等，结构简单者容易扩散，分子量大的扩散就慢，
杂质：抗生素或培养基中含有杂质，杂质本身也有扩散系统，看干扰抗生素的扩散，影响抑菌圈的大小和清晰度。

琼脂含量：含量过多影响抗生素的扩散，过少又使钢管下陷，影响抑菌圈的大小。

菌种对抗生素的吸附作用：
pH影响分子的形式、
温度影响扩散
D增大，「也增大
■T的影响：
■一般T增加，「增大，但时间太长影响抑菌圈清晰度。

■M的影响：在一定的范围内，小管内M越大，抑..菌圈直径越大，M还与抗生素的抗菌活性、浓度、钢管的大小、剂型、辅料等有关。

■C的影响：C越小，抑菌圈直径越大，C与菌种、菌量、培养基、温度等有关
■H的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。

■操作中要注意:
的菌种保存方法；定期对菌种分离纯化; 控制菌龄菌量
小和清晰度，pH 也很重要。

■ 1试验菌种：挑选合适的敏感菌; 用适宜
■ 2
一剂量法（标准曲线法）
■ 一剂量法（标准曲线法）原理：在一定范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的增减而增减。

并且抑菌圈的直径与抗生素的对数剂量成线性关系。

据此测定抗
:;蠶素浓度的对数。

8 6 4 2 O 8 6
2 2 2 2 2 1 1
杷
SSS
0.1 0.5 1 2 •
3
折出圭诫疔E/ml\
Y 二a+bX Y:抑菌圈直径 A ： 截距
方法：为了消除平板间的差异，在每一平板的含菌培养基上放置6个小钢管，相间的3个小管内加入j啦笙素标准品的某一浓度(Ck),他所产生的抑鼻窗圈責隹年筠值为，祸外3个小管内加入标准品的中心浓度
(Co),他所产生的抑菌圈直径平均值¥o
令垃=Yk ~ Yo
这样采用自身对照的方法，可以消除平板间的误差, 使结果更加准确。

f= a+bX
标准曲线的制备：做8个浓度，取24个平皿，分8组, 每组3个取平均值。

fk对X作图。

检品的效价检定：
取3个平皿，每个放6个小管。

在间隔的3 个小管内加入抗生素标准品的中心浓度(Co),另3个小管内加入估计浓度相当于Co的检品溶液。

测量出血,从标准曲线中计算出检品的浓度，在换算出每毫克的单位数。

二剂量法:
将抗生素的标准品及检品各稀释成有一定
比例的二种剂量（2： 1或4： 1）,即高剂量和低剂量，在同一平板上进行对比, 根据所产生抑菌圈大小来计算检品效价的方法。

・
Im
■UH：为抗生素检品高剂量(dT2)所致的抑菌圈直径■UL：为抗生素检品低剂量(dTl)所致的抑菌圈直径
IV
0 - D • anti log ——
W
TIZ UH-UL^SH-SL
W = -----------------
/ 二log//—logL 二logK
UH -SH +UL-SL
1＞高剂量抑菌圈直径应为20-24nm,个别
可为18-24mm,高剂量与低剂量抑菌圈直
径之差应大于或等于2rrirri。

2、底层琼脂20ml,上层5ml,每一检品所用
平板不少于4个。

3、等距安置小钢管4个，相对角为同一物质。

4、8为100±10% （更精确要求100±5%）
5、标准品与检品同质
£三剂量法:
应用高、中、低三种剂量，在同一实验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈大
小，以求得检品效价的方法。

3-7三剂量法检品与标准品间平行直线关系
S3:为抗生素标准品高剂量(dS3)所致的抑菌圈直径
S2:外抗生素标准品中剂量(dS2)所致的抑菌圈直径 生素标准品低剂量(dSl)所致
的抑菌圈直径 生素检品高剂量(dT3)所致的抑菌圈直径 生素检品中剂量(dT2)所致的抑菌圈直径 直径
IV
0 — D • anti log ——
U3 + U2 + U1-S3-S2-S1
3
TI7
U3-U1 + S3-S1 w = ----------------
4
SI:
U3：
U2：
Ul:为抗生素检品低剂量(dTl)所致的抑
/ = logK
求：
卜标准品屮剂量抑菌圈直径15-18mm
2、高、中、低剂距为上0・8
3、每一检品不得少于6个平皿
4、每板上等距安放小钢管6个
5、e：100±10% (100%±5%)
亓影响抗生素效价管碟法测定结果的丄
因素及其控制
（一）影响抑菌圈形状的因素与控制
1.稀释抗生素用的缓冲液的PH值、盐浓
响
・
pH值
團
形轆或pH盾巌，可能, 影响了抗生素对试验菌抑制作用。

2.影响
3.测试用的器材洗净度的影响
4双碟培养温度的影响
5其他操作的影响
（二）影响抑菌圈边缘清晰度的因素与控制
1■试验菌长时间放置.菌群中的一些菌株生理特 醉紅或是生长速度改变，或
对抗生素的 "学建肴所变化，往往出现双圈，抑亠1」 不蒲。

在检定时菌层培养基中的菌量影响抑菌圈，菌层 培养基中的菌量过低，抑菌圈边缘模糊不清，菌 量璋高亠使理夏圈太尘并具影灵敏度。

因俞，找出巖适Wio
2培养基的原材料品种与质量，生测用培养基用 的原務料的选择很重要。

3调节培养基的pH 值或增加适量的盐浓度可使抑 菌團清蜕
4. 不适备延长双碟的培养时间，使抑菌圈边缘 不清。

抗生素效价管碟法测定的操作技术
圈的边缘
=J
操作分为八步：
1试验菌的纯化与悬液的制备
2缓冲液、灭菌水与培养基的制备3标准品、供试品的称量、溶解与稀释
4双碟的制备及放管
5滴加药液
6恒温培养7测量抑菌圈直径或面积8计算
操作流程:
图3・9抗生素效价检定管碟法操作流程BH
右四、比浊法与管碟法比较
］第二节抗生素类药物的鉴别
一、B■内酰胺类抗生素的鉴别
CH3
RCONH!®—
----CO2H 结构的共同点：1、和内酰胺相邻的碳原子上有一竣基，2、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一功能团氨基。

分类：青霉烷类，头抱烯类,碳青霉烯类（硫霉
素）,单环B-内酰胺（克拉维酸）。

鉴别:
1、酶法: B-内酰胺酶
2、红外吸收光谱法：3000-2800 (C-H), 3350cnri
(N- H), 1800-1600基)，1460-1375 (甲基或次甲
基)
3、紫外吸收光谱法
4、弟三酮反应：是a氨基的反应，与苗三酮缩合, 生成
蓝紫色化合物。

5、色谱法：薄层色谱后，氯钳酸与硫醛基反
应是灵敏度高的显色试剂
二、氨基糖昔类抗生素
环己醇配基以糖昔键与氨基糖相连。

链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。

（一）呈色反应
1、昂三酮反应：
2、坂口反应：链霉素水解产物链霉弧特有。

链霉肌，8■径唾咻分别与
次漠酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。

3、糖类反应：莫利西反应
基乙糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成毗咯样
的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液成红色，在540nm处可定量测定。

5、麦芽酚反应:
水解、重排.麦芽酚紫红色络合物
OH「H+。