辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电化学

辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电化学

刘慧宏3　陈显堂　李　俊

Hill H.A.O.(襄樊学院化学化工系,襄樊441053)(牛津大学无机化学实验室,英国牛津)

摘　要　利用3种表面活性剂分别将辣根过氧化氢酶固定在裂解石墨棱面(edge 2plane pyrolytic graphite ,

EPG )电极表面,研究了辣根过氧化物酶(HRP )中Fe ∆/Fe Χ电对与电极之间的直接电子传递过程以及酶

催化双氧水还原过程。实验结果表明:(1)表面活性剂是一种固定酶的理想材料;(2)这种体系可能构造

第三代生物传感器,对解释生物体代谢过程具有理论意义,对制备第三代生物传感器具有应用价值。

关键词　辣根过氧化物酶,表面活性剂,直接电化学,化学修饰电极

　2000206226收稿;2000212210接受

本文系湖北省教委资助课题

1　引 言

研究氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递过程具有重要意义。一方面它为理解生物电化学和生物代谢过程提供有价值的信息,另一方面,利用电极探讨氧化还原蛋白质与底物分子之间的电子传递过

程,为制备生物传感器提供实验基础〔1,2〕。

HRP 含有辅基血红素,它是研究过氧化物酶的结构、动力学和热力学性质的代表。另外,HRP 修饰

电极广泛运用于分析过氧化氢、有机过氧化物、酚类化合物、芳香化合物以及一些环境污染物〔3〕。近几

年,利用各种材料的电极对HRP 的直接电子传递过程及催化性能进行了深入的研究,但HRP 修饰电极

的催化电子传递机理仍存在着争议〔4,5〕。而且只有少数文献描述了酶中Fe (Ⅲ

)/Fe Χ氧化还原对的电化学行为〔6〕。原因是HRP 中的电活性中心与电极之间的电子传递速度很慢。因此,研究酶的固定化材

料和方法、使酶具有适宜的环境、保持其活性、具有良好的取向以加速电子传递过程是当前十分活跃的研究课题。表面活性剂膜具有与生物体磷酯膜十分近似的结构。因而可能成为研究蛋白质的电化学提

供良好的微环境,为构造生物传感器提供新型材料〔7,8〕。

本文研究了在表面活性剂膜内的HRP 的电化学性质。实验结果证明:(1)表面活性剂是一种固定酶的理想材料;(2)这种体系可能构造第三代生物传感器。

2　实验部分

2.1　试剂和仪器

HRP (G rade Ⅱ,德国Boehringer 公司),使用时未经提纯。双十二碳烯基溴化二甲基铵(DDAB ,Aldrich 公司),双十四酰基磷酯酰胆碱(DMPC ,Signa 公司),双十六烷基磷酸(DHP ,Fluka 公司)。其它化学试剂均为分析纯,所有溶液用Milli 2Q 水配制而成。缓冲溶液(离子强度为0.1)配制:酒石酸盐pH 3.0～6.0;磷酸盐pH 7.0～8.0;硼砂pH =9.0～10.0;磷酸盐:pH =11.0。电化学测量使用计算机控制的Autolab 电化学系统(荷兰Eco.Chemie 公司)。

2.2　实验方法

2.2.1　电极的修饰　表面活性剂DDAB (10mm ol/L ),DMPC (10mm ol/L )和DHP (2.5mm ol/L )的悬浊液,超声波振荡形成分散液。等体积的表面活性剂分散液和HRP (165g/L )的磷酸盐溶液混合。取10μL 该混合液平铺于电极表面,空气干燥约12h 。制得的修饰电极分别表示为:DDAB/HRP ,DMPC/HRP ,DHP/HRP 。

2.2.2　电化学测量　电化学池由参比电极池和电化学反应池(体积约400μL )两部分构成,其间由鲁金(Lugging )毛细管连接。参比电极为饱和甘汞电极(vs .SCE K 401,Radiometer )。铂丝网为辅助电极,工作电极为EPG (Le Carbone 2Lorraine ),电化学面积由Randles 2Sevcik 方程求得为0.075cm 2。每次实验前,EPG 第29卷

2001年5月 分析化学(FE NXI H UAX UE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期511～515

电极用金相砂纸磨平,在人造毛绒上以Al 2O 3(粒度0.015μm ,BDH )悬浊液抛光成镜面。超声波震荡清洗后,进行电极修饰。实验过程中在支持电解质溶液中通N 2除O 2。

3　结果及讨论

3.1　辣根过氧化物酶的直接电化学

DDAB/HRP ,DMPC/HRP ,DHP/HRP 膜修饰电极于磷酸盐缓冲溶液(pH =7.0)中测得的C V 曲线为图1所示。均呈现一对氧化还原峰。峰的形状基本对称而且氧化和还原峰高大致相等。而不含HRP 的表面活性剂膜电极不产生法拉第电流。所以此氧化还原峰是HRP 的电活性中心与电极之间进行电子交换的结果

。

图1　酶修饰电极的循环伏安图

Fig.1　Cyclic v oltamm ograms of HRP m odified edge 2plane pyrolytic graphite (EPG )electrode

(a )DDAB/HRP ;(b )DMPC/HRP ;(c )DHP/HRP ,v =2V/s ,P BS pH 7.0。

半波电位(表1)与用电势法测定HRP 血红素Fe (Ⅲ

)/Fe Χ氧化还原对的电位值(E =-0.271V ,P BS pH 7.0,T =30℃)相近〔9〕。随着扫描速度的增加,阳极峰与阴极峰的电位差值(ΔE p )有微小的改变。

ΔE p 大于表面过程的理论值(ΔE p =0mV )。这种结果的产生可以归于HRP 的构象效应。即:HRP 分子较大且形状不太规则,电活性点埋藏较深。另外电场力的影响,导致在电位扫描过程中,引起电荷分布和空间位置的变化,使ΔE p 偏离理论的估算值。但当扫描速度高于1V/s 时,其峰电流与扫描速度成正比例,线性方程分别为:阴极峰电流:y =-0.779+9.687x ,r =0.9837;阳极峰电流:y =-0.642+91628x ,r =0.9739。表明该电化学反应为吸附在电极表面的HRP 与电极之间的电子交换过程。表1　HRP 氧化还原峰的性质

T able 1　The redox properties of horseradish peroxidase (HRP )in three surfactant film (P BS pH 7.0,ν=2V/s )

化学修饰电极

C ME

膜净电荷Film net charge E 1/2(V )ΔE p (mV )i pc /i pa DDAB/HRP/C ME

1-0.212450.83DMPC/HRP/C ME

0-0.33048 1.18DHP/HRP/C ME -1-0.38168 1.39

　C ME:chemically m odified electrod ;DHP :dihexadcylphosphate ;DDAB :didodecyldimethylamm onium ;DMPC :dimyristol phosphatidycholine 。在较宽的pH 范围内(pH 3.0～11.0)氧化还原峰随着pH 值的增加负移,且形状微有变化。但均可得到可逆、重现性良好的循环伏安图(图2)。

本实验测得酶中Fe ∆/Fe Χ电对的电位值比报道值(E =-0.50V vs .SCE )正移〔10〕,而且随着表面活

性剂所荷电荷由正到负而负移。原因是HRP 分子外表面分布着许多带电的氨基酸残基,在中性pH 条件下带负电荷(等电点pI 4.2)。所以荷正电的DDAB 通过长碳链的侵入和静电作用,有利于HRP 的活性中心与电极之间的电子交换,而且氧化还原电位随H +]的增加而正移。结果表明:(1)表面活性剂中长碳链能侵入HRP 分子中从而缩短电极与酶活性中心的电子转移路径。(2)在电极表面,酶的活性中心有良好的取向。(3)荷电的表面活性剂为酶的电子转移过程提供特殊的微环境。

当v <1V/s 时,电流与扫描速度无线性关系,i pc /i pa 远离1,当v <0.2V/s 时,阳极峰消失(图3)。

215 分析化学第29卷