《DNA重组技术的基本工具》上课用

练习5、
• 限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是 • —G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和
切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点， 在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。 • ①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性未端。
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• ②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后形成的 黏性未端。
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做一枚螺丝钉，那里需要那里上。20. 12.3015 :55:591 5:55De c-2030 -Dec-2 0
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日复一日的努力只为成就美好的明天 。15:55:5915:55:5915:55Wednesday, December 30, 2020
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安全放在第一位，防微杜渐。20.12.3020.12.3015:55:5915:55:59December 30, 2020
序列 • C．不同的限制酶切割DNA的切点不同 • D．限制酶的作用是用来提取目的基因
练习2、
• 限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分 子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶 BamHI，EcoRI，HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。 箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪 两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补 黏合？其正确的末端互补序列为何？
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相信命运，让自己成长，慢慢的长大 。2020年12月30日星 期三3时 55分59秒 Wednesday, December 30, 2020
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爱情，亲情，友情，让人无法割舍。20.12.302020年 12月30日星期 三3时55分59秒20.12.30
谢谢大家！
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加强自身建设，增强个人的休养。2020年12月30日 下午3时 55分20.12.3020.12.30
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精益求精，追求卓越，因为相信而伟 大。2020年12月30日 星期三 下午3时 55分59秒15:55:5920.12.30
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让自己更加强大，更加专业，这才能 让自己 更好。2020年12月下 午3时55分20.12.3015:55December 30, 2020
• A. BamHI和EcoRI；末端互补序列—AATT—
• B. BamHI和HindⅢ；末端互补序列—GATC—
• C. EcoRI和HindⅢ；末端互补序列—AATT—
• D. BamHI和BglII；末端互补序列—GATC—
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
• DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷 酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而 连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
4.DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：
• DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单 个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连 接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接 起来，因此连接酶不需要模板。
要切两个切口，产生四个黏性末端。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的 DNA分子了。
2、DNA连接酶——“分子缝合针” E·coli DNA连接酶（黏性末端）
（1）种类： T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端） （2）作用部位磷：酸二酯键
限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出 来的。能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列， 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键断开。
特点：特异性。
即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸 序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
大肠杆菌(EcoRΙ)的一种限制酶能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
基因工程的原理：
• 1.概念：
• 2.基因工程又叫DNA重组技术。
• 3.过程：这种技术是在生物体 ，通过对 分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的
基因进行 胞内，进行
和重新组合，然后导入受体细 繁殖，使重组基因在受体细
胞内表达。
二、基础知识：
• 4.基因工程的特点： • 1）它是一种按照人们意愿，定向改造生物遗
实质
基因重组
结果
人们需要的新的生物类型和生 物产品
• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫特性)
获取
与运载体DNA拼接
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因)
导入
棉花植株(有抗虫特性)
• 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？
• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来
4) 载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不 能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;
5) 5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进 行操作,太大就不便操作.
3.基因进入受体细胞的运载——”分子运输车”
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒
2.方法、技巧、规律总结：
• 限制酶切割的是磷酸二酯键，而DNA连接酶 连接的正是两个断开此键的DNA片段。“分 子运输车”是目的基因进入受体细胞的载体， 它具有的若干特点是基因工程鉴定、选择、 表达的关键，可以说，没有它，目的基因即 使进入受体细胞，也难以稳定保存，更谈不 上复制和表达。
• 3.思维误区提示：
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合” 起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一 个重组的DNA分子就形成了。
练习3、
• 在基因工程中用来完成基因的剪接的工具 是
• A．限制酶和连接酶 B．限制酶和水解酶 • C．限制酶和运载体 D连接酶和运载体
练习4、
• 依下图有关基因工程的工具酶功能的叙述， 不正确的是
• 两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性 质各不相同。
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生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热 爱。20.12.3020.12.30Wednes day, December 30, 2020
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人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。15:55:5915:55:5915:5512/30/2020 3:55:59 PM
§1.1 DNA重组技术的基本 工具 • 一、教学目标：
• 1.简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。 • 2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技
术创新。
• 二、教学重点： • DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。 • 三、教学难点： • 基因工程载体需要具备的条件。
一、自学导引：
• _____________________
本节内容小结：
• 1.知识梳理： • DNA重组技术的基本工具： • ①限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸
序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键；
• ②DNA连接酶（分子缝合针）：连接两核苷 酸之间的磷酸二酯键；
• ③基因进入受体细胞的载体（分子运输车）： 最常用的是细菌质粒，还有λ噬菌体的衍生物、 动植物病毒等。
• A．切断a处的酶为限制核酸性内切酶 • B．连接a处的酶为DNA连接酶 • C．切断b处的酶为解旋酶 • D．切断b处的为限制性内切酶
• 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细 胞(如棉花细胞)？
导入过程需要运输工具——载体。
• 载体的作用有哪些？
作用一：作为运输工具，将外源基因(抗虫 基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。
关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接
关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞
• 解决培育抗虫棉的关键ห้องสมุดไป่ตู้骤需要哪些工具？
关键步骤一的工具：“分子手术刀”——限制性内切
酶
关键步骤二的工具：
“分子缝合针”——DNA连接酶
关键步骤三的工具： “分子运载车”——载体
三、DNA重组技术的基本工具
1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
• DNA连接酶与DNA聚合酶根本不是同类酶， 其功能特点大不相同，注意其区别。
4.DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：
• 基因工程中所用的连接酶有两种：从大肠杆菌中 分离得到的E·coli连接酶、从T4噬菌体中分离得 到的T4连接酶。这两种酶的催化反应基本相同， 都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链 DNA。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二 酯键。
传特性的技术。
• 2）在DNA分子水平上进行操作。 • 3）是在体外进行的人为的基因重组。 • 4）一旦成功，便可遗传。 • 5）主要技术是体外DNA重组技术和转基因
技术。
总结：
基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程 切割 → 拼接 → 导入 → 表达
作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞) 内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
作为载体必须具备哪些条件？
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目
的基因插入到载体上去。
3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
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这些年的努力就为了得到相应的回报 。2020年12月30日星 期三3时 55分59秒15:55:5930 December 2020
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科学，你是国力的灵魂；同时又是社 会发展 的标志 。下午3时55分 59秒下 午3时55分15:55:5920.12.30
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每天都是美好的一天，新的一天开启 。20.12.3020.12.3015:5515:55:5915:55:59Dec-20
限制酶
限制 酶
黏性末端和平末端
当限制酶在它识别序列的中心轴线两 侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是 黏性末端。而当限制酶在它识别序列的中 心轴线处切开时，产生的则是平末端。
练习1、
• 下列关于限制酶的说法不正确的是 • A．限制酶广泛存在于各种生物中，微生物
中很少分布 • B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸
质粒：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立 于细菌染色体之外，并具有自我复制能力 的双链环状DNA分子
质粒是基因工程最常用的载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA 分子。有的一个细菌中有一个，有的一个 细菌中有多个。
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒 是大肠杆菌的质粒， 其中常含有抗药基 因，如四环素的标 记基因。质粒的存 在与否对宿主细胞 生存没有决定性作 用，但复制只能在 宿主细胞内成。