壬基酚和辛基酚联合染毒的尿液代谢组学研究

壬基酚和辛基酚联合染毒的尿液代谢组学研究

1,2 王伟华1 孙远明*

1,2

林峰*3 张明明

1

1

(华南农业大学食品学院,广州510642) 2

(

广东省食品质量安全重点实验室,广州510642)3

(广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室,广州510623)

摘 要 运用代谢组学方法研究壬基酚和辛基酚联合染毒对大鼠尿液代谢的影响㊂在高效液相色谱-

飞行时间质谱技术检测的基础上,通过主成分分析观察了联合染毒的时间-毒效应和剂量-

毒效应㊂根据主成分分析和判别分析,结合t 检验,筛选出染毒组和对照组中具有明显差异的化合物,并在Metlin Scripps Center for Mass Spectrometry 代谢物数据库中查询,推断其可能的代谢标志物㊂结果表明,壬基酚和辛基酚联合染毒后,尿液中可能出现的生物标志物有5种,分别为4,8-

二羟基喹啉-2-甲酸(黄尿酸)㊁色氨酸及N -乙酰-5-羟色胺㊁RG -13022和十六碳烯酸㊂由这些物质涉及的代谢途径,推测壬基酚和辛基酚联合染毒可能对生物体的蛋白质代谢㊁神经系统和心血管系统㊁生物节律㊁细胞抗氧化㊁性激素的平衡等方面产生毒效应,另外还可能影响细

胞的信号传递和脂类代谢㊂

关键词 壬基酚;辛基酚;代谢组学;高效液相色谱-

飞行时间质谱;生物标志物 2011-04-22收稿;2011-07-16接受本文系农业部"948"子项目(No.2009-Z45)资助*E -

mail :ymsun@;linf@ 1 引 言

烷基酚聚氧乙烯醚(APEs)是一种非离子表面活性剂,广泛用于洗涤剂㊁除草剂㊁杀虫剂㊁塑料添加剂㊁

乳化剂㊁润湿剂㊁涂料及化妆品中㊂此外,APEs 还可用作避孕药膏及凝胶的杀精子剂和避孕套的润滑剂㊂

据统计,APEs 的世界年产量约为50万吨[1],在各类表面活性剂中排第三,并且全球需求量还在增加㊂

在APEs 总量中,壬基酚聚氧乙烯醚(Nonylphenol ethoxylates ,NPEs )约占80%,辛基酚聚氧乙烯醚

(Octylphenol ethoxylates ,OPEs)约占20%[1]㊂APEs 类物质进入环境后经生物降解分别形成相应的烷基

酚(APs ),如壬基酚(Nonylphenol ,NP)和辛基酚(Ocytlphenol ,OP )[2]

㊂由于大量应用,目前NP 和OP 已通

过废水排放进入人类的食物链,在许多国家的地表水㊁饮用水㊁食品中都能检测到NP 和OP [3,4]㊂

关于NP 和OP ㊂研究发现,

NP 和OP 具有雌激素活性㊂

㊁体外试验评价了烷基酚的内分泌效应,证实NP 和OP 能够通

过与体内雌激素受体结合[7,8]㊂在给大鼠灌胃和皮下注射染毒两种情况下,观察到NP 和OP 的雌激素效应甚至比内分泌干扰物双酚A 还要强[9]㊂关于烷基酚的代谢组学及非内分泌毒性机制研究的报道非常少㊂Lee 等基于GC -MS 方法研究了NP 对雄性激素㊁雌激素㊁肾上腺皮质素的影响,认为四氢皮质(甾)酮和5α-四氢皮质(

甾)酮可作为尿液中NP 对肾上腺皮质素类物质产生影响的标志物[10],但该研究只是针对某几个特定组分的检测分析㊂

由于目前还没有完整意义上的烷基酚类代谢组学研究,而且壬基酚和辛基酚的污染又同时存在,因

此,本研究在两者等剂量混合灌胃的情况下观察了联合染毒的时间-毒效应和剂量-

毒效应,并从尿液中的代谢产物中筛选可能的生物标志物㊂本研究对全面认识烷基酚的联合毒作用特点,为科学地实施风险管理和毒性干预㊁保护人体健康具有重要的指导意义㊂

2 实验部分

2.1 实验动物和动物模型的建立Sprague Dawley (SD )大鼠,雄性,体重150~200g ,由中山大学动物实验中心提供㊂动物置于代谢笼

第40卷分析化学(FENXI HUAXUE)研究第期

分析化学第40卷中常规饲养,每笼1只,自由饮水喂食,饲养室光照12h,黑暗12h,室温20~25ħ,相对湿度40%~ 70%㊂饲养条件及实验操作均严格遵守无特殊病原菌(SPF)级标准要求㊂

将15只大鼠随机分为3组,分别为对照组㊁ON(NP+OP)低剂量组㊁ON(NP+OP)高剂量组,每组5只,置于代谢笼中常规饲养.经过一周适应后,开始灌胃染毒,对照组用花生油灌胃,染毒组用同体积的NP+OP花生油溶液灌胃,染毒剂量分别为:低剂量50mg/kg㊁高剂量150mg/kg㊂连续灌胃7d㊂灌胃次日取大鼠24h尿样,称重㊂

2.2动物尿样的处理

吸取5mL尿液于10mL塑料离心管中,以3000r/min离心5min,除去大颗粒固体杂质,吸取上层清液1mL,转移至1.5mL塑料离心管中,以12000r/min高速离心30min,取上清液200m L,用2倍体积的超纯水稀释,加入同位素25m g/L隐色孔雀石绿-D6和30m g/L羟基甲硝唑-D2混合液20m L,过0.22m m的滤膜后置于样品瓶中,上机测试㊂

2.3仪器与试剂

UFLC20A高效液相色谱仪(日本岛津公司),QStar Elite四极杆-飞行时间质谱仪(美国AB Sciex公司)㊂NP灌胃用的标准品(纯度>99%,阿拉丁试剂公司);甲酸(纯度98%,美国MERCK公司);乙腈(色谱纯,美国TEDIA公司);超纯水(18㊃2MΩcm)由Millipo系统制得㊂

2.4H P L C/Q T O F-M S分析条件和数据分析

Phenomenex Kinetex C18色谱柱(150mmˑ2.1mmˑ2.6m m);流动相A:0.1%甲酸溶液(含5%乙腈),流动相B:乙腈(含0.1%甲酸),流速0.3mL/min;柱温:45ħ;梯度洗脱:0.5~15min,0%~100%B,维持该比例3min;进样量:2m L㊂

ESI正离子模式,去簇电压5.5kV,离子源温度500ħ,脱溶剂气流量400L/h,质量扫描范围m/z50~1000,以隐色孔雀石绿-D6([M+H]+,m/z337.2545)㊁羟基甲硝唑-D2([M+H]+,m/z190.0791)进行保留时间及质谱强度的校正,以流动相中的酞酸酯类化合物([M+H]+,m/z149.0233,279.1591, 391.2843)进行实时精确质量校正㊂

质谱数据用MarkView1.2代谢组学数据处理软件进行峰提取㊁峰对齐及归一化等处理后进行主成分分析(PCA)和判别分析(DA),采用t检验考察不同组代谢物间差异的显著性㊂

3结果与讨论

3.1联合染毒对大鼠产生的剂量-毒性效应

连续灌胃染毒1,3,5和7d后的尿液代谢谱数据的PCA-DA分析结果如图1所示㊂由图1可见,染毒1d后,各组之间已完全分开㊂染毒1~7d,对照组各天的数据聚集在一起,高低剂量组各天的数据也分别聚在一起,且高低剂量组与对照组分别分布于不同区域,表明各组间代谢谱有明显差别㊂高低剂量组与对照组在分值散点的相对位置与其剂量呈较强的对应关系㊂随着染毒剂量的增加,NP和OP对大鼠的毒性增大(第一主成分的变化趋势),表明联合染毒对大鼠产生的毒性呈现剂量-效应关系㊂

3.2联合染毒对大鼠产生的时间-毒性效应

大鼠按不同剂量染毒后尿液代谢谱图的PCA-DA分析结果如图2所示㊂对于高剂量组,在染毒1~7d后,染毒组与对照组内各样本均呈聚类型分布,且各天之间均有较好的分离效果㊂

的延长,大鼠尿液代谢谱的变化越来越明显,表现出一定的时间轨迹㊂对于低剂量组,染毒各天内个样本依然明显聚集,而且各天之间也能明显分离,说明低剂量染毒条件下同样呈现出一定的时间轨迹㊂3.3潜在生物标志物的筛选

随着给药时间的延长,大鼠尿液的代谢谱也在不断变化,第5天后,染毒组与对照组之间的差别基本稳定,因此选择第5天的载荷图来进行分析(图3)㊂图3中每个点代表代谢物谱上的一个组分,大多数点集中在原点附近,只有少数点远离原点,远离原点的点为大鼠尿液在染毒过程中发生了显著变化的代谢物,其中可能包含潜在的生物标志物㊂

ON给药组与对照组的t检验图如图4所示㊂纵坐标值越大说明该组分偏离原点的位置越远,越有