!噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用

　第13卷第1期　2005年1月

中国兽医寄生虫病

Chinese

Journal of Veterinary Parasit ol ogy

Vol .13No .1　Jan .2005　

收稿日期:2004208209

噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用

王欣之　傅志强

(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所,上海200232)

摘　要:本文主要介绍了噬菌体展示系统的原理,并就噬菌体表面展示系统的不同表达载体类别,分别做了描述,同时讨论该展示系统在抗原表位研究上的应用。关键词:噬菌体展示;随机肽库;抗原表位

中图分类号:Q939.48 文献标识码:A 文章编号:100520868(2005)0120042204

PHAGE D I SPLAY RAN DOM L I BRAR Y AND I TS

APPLY I N EP I TO PE RESEARCH

WANG W in 2zhi,F U Zhi 2qiang

(Shanghai Institute of D o m estic A ni m al Parastitology,Shanghai 200232,China )

Abstract:　This paper maj ors in intr oducing the p rinci p le of phage dis p lay syste m ,and describing the s orts of this syste m individually as different exp ress vect or .Furher more,we discusse the app licati on of this syste m es pecial 2ly in ep it ope research .

Key words:　phage dis p lay;random library;ep it ope 抗原表位(ep it ope )或抗原决定簇(antigen de 2ter m inant )一般有两种类型:一种是连续抗原表位,其氨基酸序列在一级结构上是连续的;另一种是不连续的,由一级结构上不连续的氨基酸残基经过肽链的空间折叠而聚集在一起形成的。研究抗原表位的方法很多,对于连续的抗原表位一般采用合成一系列部分重叠的小肽来确定表位的位置以及每个氨

基酸残基的作用[1]

,对于不连续的抗原表位,则可以采用表面模拟合成(surface si m ulati on synthesis )技术等。这些方法都有很大的局限性:需要预先知道该表位的一级结构的序列或结构信息。

随机肽库(Random pep tides library,RP L )是包括了20种氨基酸所有可能排列的多肽的组合体。按表达载体的不同,随机肽库又分噬菌体、质粒、细菌、核糖体等表面展示随机肽库和化学合成的随机肽库等,其中表面展示的随机肽库及其筛选技术最成熟,应用也最广泛。

1　噬菌体展示的基本原理

S m ith (1985)最先将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示

技术[2]

。

噬菌体展示技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术。这项技术的主要原理是将蛋白质或多肽的DNA 序列插入到噬菌体颗粒外壳蛋白的一个结构基因的适当位置,外源基因随外壳蛋白的表达而表达,由于被修饰了的外壳蛋白仍然保持与噬菌体颗粒的兼容性,外源基因产物随病毒颗粒的

重新组装而展示到病毒外壳蛋白的表面[3]

。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物活性。通过反复的亲和选择和扩增,可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些地区生物活性并分离出带有目的基因的噬菌体。

2　噬菌体表面展示系统

按表达外源蛋白的噬菌体类别的不同,可将噬

菌体展示系统分为丝状噬菌体展示系统、

λ噬菌体

展示系统、T4噬菌体展示系统、噬菌粒展示系统等4类。

2.1　丝状噬菌体表面展示随机肽库　丝状噬菌体是遗传分子库较为理想的载体。丝状噬菌体属于单链DNA病毒,包括M13,f1和fd噬菌体,均有一个约7000个核苷酸的单链闭环DNA分子,一级结构极为相似(99%同源性),其基因组编码10种蛋白,作为载体,它的长度可以随插入DNA的大小而变化[5]。它们只能感染含F因子的大肠杆菌,所以通称为Ff噬菌体。基因组的复制型是双链DNA,将外源片段克隆进入载体的操作比较容易,可以产生大量含有外源DNA某一条链的DNA分子。目前M13的全部核苷酸已测定,已知在基因Ⅱ和Ⅳ之间有508个核苷酸的间隔区,外源DNA片段插入这个区对噬菌体几乎没有影响[4]。这类噬菌体还有一个非常重要的特点,即具有很好的免疫原性,有实验表明,产生抗fd的抗体不需要任何佐剂,这一特性在进行生物疫苗的开发上具有重要价值。

与丝状噬菌体展示密切有关的是两种不同的结构蛋白,PⅢ和PⅧ。外源基因插入到外壳基因Ⅲ或Ⅷ时,外源多肽与PⅢ或PⅧ的N端连接,即以融合蛋白形式展示在噬菌体表面。这种载体称之为类型Ⅲ和Ⅷ。

次要外壳蛋白PⅢ位于噬菌体末端,含有406个氨基酸呈环状或线状,其C端锚在外壳上,N端游离在外,外源多肽或蛋白质与PⅢ的N端连接后,可独立展示其结构域。

主要外壳蛋白PⅢ,位于噬菌体外侧,含50个氨基酸,C端与DNA结合,N端伸出噬菌体外。外源小肽可与PⅧ的N端融合,融合蛋白必须送到细胞质膜上切除信号肽后,才能被组装而演示。这两种蛋白均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质,但各有优点。

PⅢ蛋白展示系统:基因Ⅲ蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋白质的大小无严格限制,大至50kD的蛋白质已被成功展示,PⅢ的拷贝数只有3～5个,有两个位点可供外源序列插入(N 端和近N端可伸屈臂内),PⅢ可以筛选高亲和力的抗原决定簇,故大多数研究者常利用PⅢ作为外源多肽或蛋白融合部位,但PⅢ很容易为蛋白酶水解,在免疫学和生物疫苗研究中受到限制;

PⅧ蛋白展示系统:PⅧ拷贝数多达2700个左右,因此用PⅧ可筛选低亲和力的配体,但小分子质量的PⅧ不能容纳多于6个氨基酸残基外源多肽,使外源肽于PⅧ的融合受到限制,因为较大的多聚蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配,使其失去感染力。高拷贝PⅧ在疫苗开发上具有潜在的应用价值。

PⅥ蛋白展示系统:PⅥ暴露于噬菌体表面C端可以与外源序列融合,虽然它的效率比PⅢ低,但他对于展示随机c DNA片段的C端结构域是非常有利的。

2.2　λ噬菌体展示系统

2.2.1　PⅤ展示系统　λ噬菌体基因Ⅴ编码的主要尾部蛋白形成管状结构,由32个盘状结构组成,每个盘状结构又由6个PⅤ亚单位组成。PⅤ有两个折叠区(f olding domain),C端的折叠区是病毒的非功能区,可供外源序列插入或替换[6]。λ噬菌体展示系统不必经过蛋白分泌,可以展示难以分泌的多肽,可以作为丝状噬菌体系统的有效补充。

2.2.2　D蛋白展示系统　D蛋白是λ噬菌体头部组装必需蛋白,分子量11K D。λ噬菌体颗粒的两个结构单位头部和尾部是分别组装的,在头部组装过程中先形成支架状前头,然后水解加工成前头,当DNA进入头部以后,D蛋白附着于病毒衣壳的外侧,将噬菌体头部锁住,使之围绕DNA就位[7]。因此,正常情况下,D蛋白在噬菌体头部形态发生是必需的。但是,当噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,它可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可以作为外源序列融合的载体。

2.3　T4噬菌体展示系统 将外源多肽与T4噬菌体的小外衣壳蛋白(s mall out cap sid p r otein,S OC) C端融合而被展示[8]。S OC是一个分子量为9k D 的小蛋白,是T4组装所必需的,而且不论在体内还是在体外,他都具有与成熟衣壳表面特定位点高亲和力地专一结合的能力。T4噬菌体在宿主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此可以展示的多肽范围广,尤其适用于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质。

2.4　噬菌粒展示系统 在大肠杆菌表达质粒载体中引入丝状噬菌体的复制起点时,该质粒能够以单链DNA的形式包装在噬菌体的衣壳之中,被包被的在噬菌体衣壳中的单链质粒DNA称为噬菌粒[9]。噬菌粒是一种“假”噬菌体,其复制、包装有关的功能均有辅助噬菌体提供。适当的抗性选择标记能够使噬菌粒DNA和辅助噬菌体DNA共存于细胞中,而辅助噬菌体本身并不能复制、包装,由此形成的噬菌粒也可以用来表达外源肽,并且噬菌粒比常规噬

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