生物工程毕业论文

毕业论文

人工化学法全基因合成

学生姓名XXX

学号

院系生物工程

专业生物制药

指导教师

二0XX年五月二十日

人工化学法全基因合成

XXX

湖北荆楚理工学院生物制药专业

摘要：人工化学法全基因合成就是在已知DNA序列的情况下，通过设计引物，拉出全长目的片段并将该段DNA序列克隆到特定的载体里，通过菌检验证得出目的基因已经克隆到载体质粒，最后测序得到克隆基因的序列并与已知DNA序列完全相同无突变的过程。

全基因合成的方法目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录

法、从细胞基因组直接分离法和人工化学合成法，这些方法都有一个前提，就是已有文献报道所研究的目的基因的蛋白序列或者基因的序列。

1）反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，设计上下游引物，借助反转录酶合成碱基互补的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，亦即目的基因的双链DNA。

2）基因组扩增法：利用基因组抽提试剂盒，可以从细胞、植物、血液、动物组织中直接分离基因组，设计特异扩增的引物，利用抽提的基因组为模版，直接PCR扩增，以获取目的基因。

3）人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，或基因序列，设计全长引物，利用OVERLAP方法形成模版DNA，再利用PCR扩增的方法得到双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体或者表达载体中。化学合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法，同时可以依据密码子在不同宿主细胞的偏爱性和不同的实验需求，设计基因序列，提高表达水平。

1流程概观

已知DNA片段设计引物引物的合pcr扩增PCR得到

目的短片段二次pcr 目的片段拼接全长TA克隆克隆到目

的载感受态细胞转化菌液pcr菌液检测测序

对比序列突变修复得到正确结果确定与已知DNA片

段一至。

2具体操作及各方面注意的事项

当我们研究细胞生物学的时候，我们有时会需要研究一些特定的基因所表现的显性或隐性性状，而我们又没有这段基因的现成模板，这时我们就要通过人工合成的方法制备这段特殊的基因。

（1）引物的设计与合成我们都知道DNA是双链螺旋状的，是由腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）

鸟嘧啶（G）四种碱基，磷酸分子和糖类借由脂键相

连组成其长链骨架。这里我们要说下PCR及PCR体

系中七大成分即引物、酶、dNTP、模板、缓冲液、阳离子和

双蒸水,PCR就是聚合酶链式反应PCR是一种体外DNA

扩增技术，是在模板DNA、引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下，

依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两

侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延

伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从

而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，它是用于

DNA的胞外复制，可用于在DNA模板的量不够时

对其进行复制和特定DNA的制备。DNA的复制是

从5＇到3＇进行的，引物（primer）分上游引物（以

下简称引物F）即正向引物和下游引物（以下简称引

物R）即反向引物，每两条正反引物组成一对。所

以在引物设计是都是2的倍数。一般的PCR只用一

对引物，全基因合成时看所需的全长大小而定，在

120（bp）碱基以下的两条引物就够了。大于120bp

的要看全长。一条引物的长度在60bp左右。这里要

说明的是在一般的pcr扩增时的引物是15bp到

30bp。引物的合成有相关的规则详解可以查《分子

克隆实验指南》。引物的合成是用的化学方法合成碱

基，碱基的合成在2个工作日左右。

（2）PCR拉片段其实这一步可以归到拉全长里的，但是用引物进行拼接全长时，在1200bp就很难拉出来

了，1800bp以上的就不可能拉的出来了。所以在比

较长的的全基因合成时都会拉小片段。我感觉PCR

扩增在200bp——600bp时的扩增效率是最好的，在

1200bp以下的全长基本都能直接p出来的，所以就

说下bp数较大的全基因。我们可以以6条或8条引

物为最小单位来拉片段，首先取每条引物10ul混合

在一起标上primer mix，以primer mix当作模板

（template）然后用第1条和第6条引物作为正反向

引物在150ul的EPg管中配成pcr体系：

template(primer mix) 3ul

primer F 1ul

primer R 1ul

dntp 1ul

10*buffer 3ul

Pfu emzqme 1ul

ddwater 20ul

totle 30ul

在PCR仪上设置程序：

95℃1min

95℃18s

56℃18s 25cycles

72℃20s

72℃7min

4℃forever

将以扩好的东西从PCR仪中拿下候，加入5ul的溴酚蓝（染料）并进行电泳，点胶的时候点上看条带大小的maker。跑胶后会有

300bp左右的条带，

然后切胶回收（）

图为500bp。

这里介绍一种

胶回收试剂盒，试

剂盒就是由有操作

步骤的说明书和全

部配套的实验用

品。如我们常用的“S”型试剂盒:试剂有溶胶用的bufferDE-A（红色）,buffered-B（无色）,异丙醇洗脱用的bufferW1，bufferW2还有洗液TE。实验用具有2ml离心管2ml无盖离心管、吸附柱、1.5mlEP管。操作是：切胶放到2ml离心管加入400ulbuffeDE-A置于恒温水浴锅中70℃溶胶20min，溶胶后加入200ul bufferDE-B摇匀溶液变黄，继续加150ul异丙醇摇匀，将混合液转入吸附柱内放在2ml无盖离心管上静置1min，3600转／min离心1min，弃废液加500ulbufferW1 3600转／min离心1min，弃废液加500ulbufferW2 3600转／min离心1min（重复一次），转移吸附柱到1.5ml离心管，静置8——10min，加30ulTE12000转／min离心1min，得到的30ul物质即以纯化的pcr产物。

（注意：1电泳是用1*的琼脂糖凝胶，里面含有EB是强致癌