RNAi技术在植物基因功能研究中的应用

Ｒ ＮＡｉ 被生物学家称为生物 体 在基 因 组 水 平 上 的 免 疫 系统， 也为植物基因功能的研究提供了新的思路和技术平 台， 即利用 Ｒ ＮＡｉ 技术进行逆向基因分析。针对某个已知的 基 因 ， 设 计 可 诱 导其 沉 默 的 双 链 Ｒ ＮＡ， 通 过 合 适 的 手 段 导 入细胞或机体， 使该基因表达水平下降或完全沉默。观察基 因表型的变化， 鉴定基因在基因组中的功能。这仅仅是使表 达暂时降低或抑制， 基因的信息仍是完整的。
（ ×１０６ｍ３／ ａ）
小计
５ ０８８．７
４９１．０
７７．８
污染物
水田 旱田
村
镇
总计 占比例∥％
水田
１ ２８９．０
１８２．９
２９．８
旱田
１６２．５
１６．５
２．４
ＣＯ ＤＣｒ 总氮
３７７．２ ２７３．５ ６０２．２ ３１２．４
２３７．７ ２９４．７ １ １８３．２ １８５．０ ２４３．３ １ ３４２．９
对 模 式 生 物 的 研 究 发 现 ［２］， 生 物 体 内 外 源 或 内 源 的 ｄｓＲ ＮＡ 经酶切， 可形成具有 ５’末端磷酸基、３’末端羟基和 ２ 个突出的单链核苷酸的信号分子 ｓｉＲ ＮＡ， 诱发 Ｒ ＮＡｉ 机制。 最近研究中还发现， 在植物中除了转录后水平沉默（ ＰＴＧＳ） ， Ｒ ＮＡｉ 也能在基因的转录水平（ ＴＧＳ） 上发挥作用。 ２．１ 酶的作用
Ｒ ＮＡｉ 技术是将人工合成或载体表达的小的双链 Ｒ ＮＡ （ ｓｉＲ ＮＡ） 导入 真 核 细 胞 ， 促 使 内 源 Ｒ ＮＡ 降 解 ， 高 效 特 异 阻 断体内特定基因的表达， 诱使细胞表现出特定基因缺失表 型， 获得功能丧失或降低的突变体。Ｒ ＮＡｉ 技术具有高度的 特异性和高效的干扰活力， 是研究基因功能的强有力的工 具而被广泛应用。 ２ ＲＮＡｉ 的作用机制
作者简介 黄丹莹（ １９７９－ ） ， 女， 广东揭阳人， 在读硕士， 从事植物生化 与分子生物学研究工作。
收稿日期 ２００７－ ０８－ ０１
１８８
ｄｓＲ ＮＡ， 在 Ｄｉｃｅｒ 酶 的 作 用 下 被 切 成 ｓｉＲ ＮＡ， 重 复进 行 分 裂 靶 ｍＲ ＮＡ。 ３ ＲＮＡｉ 技术在植物基因功能方面的研究
１７．１９ １９．５１
龙湾区
村
５３３．５
３６．９
４．４
总磷
１ ９６０ ９０２
４４４．０ １ ０５０．０ ４ ３５６．０ ６３．２９
镇
１ １４０．２
８３．７
１８．０
总计
２ ９３９．４ １ ４８７．９ ８６６．７ １ ５８８．０ ６ ８８２．１
－
小计
３ １２５．２
３２０．０
５４．６
占比例∥％ ４２．７１ ２１．６２ １２．５９ ２３．０７
工作研究
《现代农业科技》２００７ 年第 １８ 期
ＲＮＡｉ 技术在植物基因功能研究中的应用
黄丹莹 １， ２
（ １ 揭阳职业技术学院， 广东揭阳 ５２２０００； ２ 华南农业大学生命科学学院）
摘要 Ｒ ＮＡｉ 技术是研究基因功能的重要工具。其原理是对某个已知基因， 设计诱导其沉默的 ｄｓＲ ＮＡ， 通过合适手段导入细胞或机体 使产生干涉效应的信号分子 ｓｉＲ ＮＡ， 导致基因表达水平下降或完全沉默。通过基因表型变化， 鉴定该基因功能。从 Ｒ ＮＡｉ 的 研究 背 景和 作 用机制出发， 对近年来利用 Ｒ ＮＡｉ 技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。
表 ５ 塘河流域四种地表径流污染负荷
（ ｔ／ ａ）
污染物
水田
旱田
村
镇
总计
表 ４ 塘河流域径流负荷量调查结果
（ ｔ／ ａ）
ＣＯ ＤＣｒ
４ ２４３．８ ３ ０７６．４ ２ ６７４．７ ３ ３１５．７ １３ ３１０．６
市（ 区）
径流类型 水田
ＣＯ ＤＣｒ ６９３．４
总氮 ９８．４
总磷 １６．０
总氮
６０２．２ ３１２．４
研究表明， 在植物体中， 信号分子 ｓｉＲ ＮＡ 可通过植物的 维管系统运输。通过韧皮部进行长距离运输或通过胞间连 丝 进 行 细 胞 与 细胞 之 间 的 转 运 。将 目 标 基 因特 异 性 序 列 以 正向和反方分别插入标记基因或内含子的 ５’端和 ３’端， 再 在一端连接一个启动子， 用转基因技术将反式重复的外源 基因导入生物体， 诱 导表 达 发 夹 结 构 的 转 录 产 物 ＲＮＡ （ ｉｐｈＲ ＮＡ） ， 能产生稳定遗传的 Ｒ ＮＡｉ 现 象［５］， 其 诱 导 目 的 基 因沉默效率高， 适用性广， 应用潜力大。ｄｓＲ ＮＡ 或ｉｐｈＲ ＮＡ能 通过以下几种方法呈递到植物体内。 ３．１．１ 微 弹 轰 击 法 。将 ｄｓＲ ＮＡ 或 含 内 含 子 的 发 夹 结 构 Ｒ ＮＡ（ ｉｐｈＲ ＮＡ） 表达载体显微注射入植物体内。 ３．１．２ 农杆菌介导法。将带有能转录成 ｉｈｐＲ ＮＡ 的反式重 复的外源基因的 Ｔ－ ＤＮＡ 质粒， 通过农杆菌介导整合到植 物基因组上。 ３．１．３ 病毒 诱 导 基 因 沉 默 （ ＶＩＧＳ） 。目 标 序列 整 合 入 病 毒 基 因序列， 通过农杆菌介导转化 ｉｈｐＲ ＮＡ 表达。 ３．２ 相关的干涉载体
村 径 流 最 小 。ＣＯＤＣｒ、总氮 、总 磷 负 荷 量 分 别 为 １３ ３１０．６ｔ、 １３４２．９ｔ、２１７．８ｔ， 总 等 标 排 放 量 为 ６８８２．１×１０６ｍ３／ ａ。建 议 加 强
村径流污染物负荷最小。ＣＯＤＣｒ、总氮、总磷三种污染物负荷 对地表径流污染的重视程度， 采用合理施肥、改善村镇 卫 生
小计
２ ７５６．８
２６５．４
４２．５
水田
１ １４３．２
１６２．２
２６．４
旱田
１ ５７６．１
１６０．１
２３．１
污 染 物 中 ＣＯＤＣｒ 占 １７．１９％， 总 氮 占 １９．５１％， 总 磷 占 ６３．２９％ （ 表 ６） 。
瓯海区
村
镇
１ ２２６．０
８４．８
１０．２
１ １４３．４
８３．９
１８．１
表 ６ 四种地表径流的等标排放量评价
ｄｓＲ ＮＡ 进入细胞后， 在 Ｄｉｃｅｒ 酶作用下被裂解成ｓｉＲ ＮＡ， 双链解开为单链， 并和某些蛋白质相结合形成 ＲＮＡ 诱导的 沉默复合体（ Ｒ ＩＳＣ） 。在 ＡＴＰ 的作用下， 活化解链 ｓｉＲ ＮＡ 指 导 活 化 的 Ｒ ＩＳＣ 分 裂靶 ｍＲ ＮＡ。另 外 ， 在 Ｒ ｄＲ Ｐ 作 用 下 ， 以 ｓｉＲ ＮＡ 为 模 板 合 成 ｍＲ ＮＡ 互 补 链 ， 结 果 ｍＲ ＮＡ 变 成
１８５．０
２４３．３
１ ３４２．９
总磷
９８．０
４５．１
２２．２
５２．５
２１７．８
旱田
６６４．１
６７．４
９．７
鹿城区
村
７２０．１
４９．８
６．０
镇
６７９．２
４９．８
１０．８
Baidu Nhomakorabea
标排放量为 ６ ８８２．１×１０６ｍ３／ ａ， 四种地表径流污 染 率 指 数 分 别是： 水田 ４２．７１％， 旱田 ２１．６２％， 村 １２．５９％， 镇 ２３．０７％。三种
［Ｊ］．浙江大学学报， ２００２， ２８（ ２） ： １４７－ １５０．
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（ 上接第 １８８ 页）
须改进植物基因干涉载体的转化方法， 加快新载体的开发；
包括全部拟南芥基因组的 ｉｈｐＲ ＮＡ 转基因系［７］。澳大利亚的 第三， 并非所有基因都可被沉默， 表达 水 平 低的 基 因 Ｒ ＮＡｉ
体的开发加快了植物功能基因组的研究。 ３．３ ＲＮＡｉ 为 注 释 和 认 识 同 源 基 因 及 功 能 提 供 了 快 速 、高 效的鉴定方法
析的新技术， 有着不可估量的应用价值。可以预见， 随着Ｒ ＮＡｉ 技术的不断完善， 植物基因功能的研究和应用将取得更大 成果。
比较接近的物种， 可通过比较基因组加快研究进度。利 用传统基因敲除或反义 ＲＮＡ 的方法使基因沉默来研究基 因家族的功能， 往往难以达到理想效果， 但应用 ＲＮｉ 技术 能 更 好 地 研 究 同 源基 因 。Ｆｒａｎｋｉｓｈ［４］使 用 Ｒ ＮＡｉ 的 方 法 ， 证 实 通过 合 理 设 计 双 链 Ｒ ＮＡ， 可 有 效 地 同 时 沉 默 １ 个 基 因 家 族， 为多倍体物种的功能基因组学研究指明了方向。 ４ ＲＮＡｉ 技术在植物功能基因组研究中的应用展望及挑战
－
１００．０
水田
１ １１８．２
１５８．７
２５．８
旱田
６７３．７
６８．４
９．９
塘河瑞安片 村
１９５．３
１３．５
１．６
镇
３５２．９
２５．９
５．６
３ 小结 通过调查表明， 温瑞塘河流域每年因四种地表径流进
小计
２ ３４０．１
２６６．５
４２．９
入水体的污染负荷中， 水田径流中各污染物的负荷量最大，
２．２ 塘河流域四种地表径流污染负荷的比较 从表 ５ 可以看出， 水田径流中各污染物的负荷量最大，
关键词 基因沉默； Ｒ ＮＡｉ 技术； 植物基因功能
１ ＲＡＮｉ 的研究背景 １９９８ 年， Ｆｉｒｅ 等［１］发现， 过去利用正反义 Ｒ ＮＡ 阻断基因
表达都是因体外制备的单链 ＲＮＡ 中污染极少量双链 ＲＮＡ （ ｄｓＲ ＮＡ） 所 引 起 的 ， 并 发 现 在 线 虫 中 导 入 ｄｓＲ ＮＡ， ｍＲ ＮＡ 明显减少， 推论存在某种机制特异地破坏降解内源 ｍＲ ＮＡ， 导 致 某 个 基 因 沉 默 ， 即 转 录 后 基 因 沉 默 （ ＰＴＧＳ） 。在 此 情 况 下， 启动子是活跃的但不能正常积累 ｍＲ ＮＡ。这种现象被称 为 Ｒ ＮＡ 干 涉 （ Ｒ ＮＡｉ） 。研 究 表 明 Ｒ ＮＡｉ 现 象 广 泛存 在 大 多 数真核生物中， 起到自行监控细胞中异常的 ｍＲ ＮＡ、封闭该 基 因 表 达 、抵 御 病 毒 感 染 及 阻 断 转 座 子 的 作 用 。
ＣＳＩＲ Ｏ 公 司 也 构 建 出 多 种 适 用 于 禾 本 科 植 物 的 Ｒ ＮＡｉ 载 现象不明显。对多因一效基因或同源性较高的基因家族， 干
体— ——ｐＨａｎｎｉｂａｌ 和 ｐＫａｎｎｉｂａｌ 质 粒 载 体 系 列［７］。还 有 用 于 高 涉 会 同时 作 用 这 些 基 因 ， 沉 默 表 型难 以 鉴 定 ； 另 外 ， 基 因 被
Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ 及其同事利用 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司的 Ｇａｔｅｗａｙ 重组 克隆技术， 构建高通量基因沉默的载体系列ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ，
（ 下转第 １９０ 页）
工作研究
《现代农业科技》２００７ 年第 １８ 期
的区 域 ， 产 流 面 积 相 对 较 小。所 以 ， 这 两 个 区 （ 市 ） 四 种 地 表 径流污染物负荷相对较低。
通量植物功能基因组构建的载体系列， 包括适合组成型表 沉默的表型与转基因时所引起的插入突变表型， 有时难以
达、诱导型异常表达的 ＧＵＳ 或 ＧＦＰ 融合蛋白双元载体， 和 区别。
以烟草花叶病毒为基础构建的高通量 ＶＩＣＳ 载体系列。新载
Ｒ ＮＡｉ 作为后基因组时代 基 因 功能 验 证 和 表 达 调 控 分
参与 Ｒ ＮＡｉ 发生的 Ｄｉｃｅｒ 酶特异识别 ｄｓＲ ＮＡ， 该酶 依 赖 ＡＴＰ， 能 将 转 基 因 和 病 毒 感 染 等 引 入 的 ｄｓＲ ＮＡ， 逐 步 切 割 成 含 ２１－ ２３ 个 核 苷 酸 ｓｉＲ ＮＡ， 启 动 细 胞 内 Ｒ ＮＡｉ 反 应 。 Ｒ ＮＡｉ 过程的另一种重要的酶是 Ｒ ＮＡ 指导的 Ｒ ＮＡ 聚合酶 （ Ｒ ｄＲ Ｐ） 。Ｒ ｄＲ Ｐ 的作用， 使进入细胞内的 ｄｓＲ ＮＡ 数量呈指 数级扩增， Ｒ ＮＡｉ 效应得以放大。故少量 ｄｓＲ ＮＡ 可使大量靶 ｍＲ ＮＡ 大幅度下调。 ２．２ ＲＮＡｉ 过程
量 从 大 到 小 依 次 为 ＣＯＤＣｒ １３３１０．６ｔ 、总 氮 １３４２．９ｔ 、总 磷 设施、建地表径流集水塘等措施减少对塘河的污染负荷。
２１７．８ｔ。
４ 参考文献
２．３ 四种地表径流等标排放量评价结果
［１］ 钱秀红， 徐建民．杭嘉湖水网平原农业非点源污染的综合调查和评价
四种地表径流中 ＣＯ ＤＣｒ、总氮、总磷等三种 污 染 物 总 等
最初在植物中研究 Ｒ ＮＡｉ 的实验是使水稻中报告基因 ＧＵＳ 沉默， 来 比 较 正 义 链 、反 义 链及 ｄｓＲ ＮＡ 诱 导 Ｒ ＮＡｉ 效 率的高低。近年来利用 Ｒ ＮＡｉ 技术在水稻、拟南芥、芸薹属、 油菜、烟草及棉花上， 已经进行了一些基因功能验证的相关 研究［３］。其中研究最深入的是应用 Ｒ ＮＡｉ 技术进行大 规 模 拟 南芥功能基因组的分析， 以获得拟南芥全基因组高质量的 基因序列标签（ ＧＳＴ ） ［４］。 ３．１ 植物体中的 ＲＮＡｉ 诱导方法