高效液相色谱

2 高效液相色谱仪
储液器 真空脱液器
高压泵
自动进样器 柱温箱
检测器 馏分收集器
图1 高效液相色谱仪示意图
由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统 组成。
进样系统
分离系统
高压输液系统
图2 高效液相色谱仪示意图
数据处理系统
检测系统
HPLC组成 主要部分：高压输液系统、进样系统、分离 系统和检测系统。
100mg
1g
高效液相色谱与经典液相色谱比较
➢ 与经典液相色谱的工作原 理相同，但使用效能却远 大于经典的液相色谱；
➢ 高效液相色谱又被称为 现代液相色谱。
（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效 可达30000块/m理论塔板数；
（2）高灵敏度：在高效液相色谱中常使用的紫外吸收检测 器的最小检测量可达10-9g，而荧光检测器的灵敏度可达10-11 g，非破坏性；
2.2 进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，把分 析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
微量注射器
定量管
采样
进样
六通阀进样器工作原理示意图
手动进样阀
定量管 接头
柱外效应
柱外展宽（柱外效应） ：色谱柱外的因素所引 起的峰展宽。主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。可分柱前和柱后展宽。
高效液相色谱
1 概述
高效液相色谱法（HPLC， high performance liquid chromatography）发展于20世纪60年代末；
它不受样品挥发性的限制，可完成气相色谱法不 易完成的分析任务；
适于分析沸点高、难气化、分子量大、受热不稳 定的有机化合物、生物活性样品，这些化合物约 占有机化合物ห้องสมุดไป่ตู้80％。
（3）分析速度快：由于使用了高压输液泵，输液压力可达 40MPa，流动相流速大大加快，完成一个样品分析，仅需几 分钟至几十分钟，与经典的液相色谱相比，分析时间大大缩 短；
（4）高选择性：不仅可分析有机化合物的同分异构体，使 用手性固定相还可分析性质上极为相似的光学异构体。
例如：
分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。 氨基酸分离： 经典色谱法： 20h分离出20种氨基酸（柱长约170cm， 柱径0.9cm，流动相速度30cm3/h）。 高效液相色谱法：lh。 用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，梯 度洗脱，0.5h内分离出尿中104个组分。
与气相色谱比较
（1）缺少像气相色谱法中使用的热导检测器、氢火 焰离子化检测器那样的通用型检测器；
（2）使用多种溶剂，成本比气相色谱法高，而且易 引起环境污染；当进行梯度洗脱操作时，比气相 色谱的程序升温操作复杂；
（3）不能完成柱效在10万块理论塔板数以上的、组 成复杂的样品分析，也不能代替中低压柱色谱去 分析受压易分解，变性的样品。
2.4 检测系统
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器 的要求是：灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死 体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。
检测器的基本类型：
高效液相色谱柱（柱长约5～30cm）比气相色谱 柱短得多，所以柱外展宽较突出。
进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效 液相色谱法中对进样技术要求较严。
2.3 分离系统—色谱柱
色谱柱是液相色谱的核心部件，包括柱管与固定相。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的
聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，故金属管用 得较多。
目前，在食品、化工、医药等诸多行业被广泛地 应用。
各种加压液相色谱大体分离规模
分析型HPLC, 400bar 制备型HPLC，大于20大气压 LPLC低压柱色谱，低于5个大气压 快速柱色谱（flash chromatography) 2个大气压 MPLC,中压柱色谱，5-20大气压
ug 1mg
10mg
目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机 械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用 最多的是机械往复泵。
往复泵示意图
过滤器
设置在高压输液泵进口和出口与进样阀之间，防 止输液泵柱塞和进样阀阀芯损坏，以及因柱头阻塞引 起柱压升高。
溶剂过滤器、管道过滤器
脉动阻尼器
设置在高压输液泵出口和色谱柱进口之间，用于 消除往复式柱塞泵输出的压力脉动。
辅助装置：自动进样、馏分收集、数据处 理等。
HPLC工作过程：
高压泵将贮液器中流动相经进样器送入色谱柱，然后 从控制器的出口流出。 注入欲分离样品时，流经进样器贮液器的流动相将样 品带入色谱柱进行分离，依先后顺序进入检测器。 记录仪记录检测器送出的信号，得到液相色谱图。
2.1 高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，对流动 相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高 压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件， 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻 力器、梯度洗脱装置和压力表等组成。
梯度洗脱装置
梯度洗脱：在分离过程中使两种或两种以上不同 极性的溶剂，按一定程序连续改变它们之间的比例， 使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变 化，提高分离效果，缩短分析时间。
梯度洗脱装置分为两类：
➢外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常 压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 ➢内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别 用泵增压后，按设置的程序，注入梯度混合室混合， 再输至柱系统。
一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色 谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以 上。
一般在分离柱前装有一个预柱，柱内填充物 和分离柱完全一样，可使淋洗溶剂经过前置柱 （预柱）时为其中的固定相饱和，使它在流过 分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱性 能不受影响。（减少不可逆吸附和固定相的流 失）
（1）储液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容 量为1到2L。
高压输液泵
!关键部件之一。将储液罐中的流动相以高压形式连续
不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
!分类：恒流泵和恒压泵。
•恒流泵：输出流量保持恒定，与色谱柱引起阻力变化无 关；
•恒压泵：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差。