细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养

小鼠肝细胞原代培养

小鼠肝细胞原代培养

实验目的：

1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理

2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法

实验器材：

二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。一般采用2-5代的细胞进行实验。当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：

组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：

1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养

皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培

养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

3.培养：通过生长繁殖，细胞可以从组织块边缘向四周游出，最终生

长繁殖连成片，原组织块可以完全消失。

离散细胞原代培养：

动物细胞在体内有严密的组织结构，多数组织的形态是固体结构，细胞与细胞或者细胞与细胞间质之间联系紧密，要得到大量的离散细胞就必须进行人工分离（消化培养）。也有部分组织的细胞自然状态下就是松散的，从体内取出后不用处理（如血细胞）或稍加处理（如脾细胞）就可以得到细胞悬液。细胞离散后由于每个细胞都能与支持物接触，营养供应均匀，因此适应快、增殖快、建系快。

通常的离散细胞原代培养步骤为：取材、剪切、消化、接种。

原代培养的细胞往往在制备时含有很多细胞种类，这就需要对分离的细胞进行纯化，细胞纯化分为悬浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。

悬浮细胞纯化多使用密度梯度离心法和表面抗原法（需要固化的抗体，如各种细胞分离柱）。

贴壁细胞纯化通常是细胞贴壁法（依据贴壁的快慢）和酶消化法（依据贴壁的细胞对消化酶的敏感程度不同）。

肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，50个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20微米，有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。

肝细胞具有多种功能且代谢旺盛，离体培养的大鼠肝细胞用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究有许多优点。医学上常培养肝细胞作为理想的体外模型,在肝病研究、护肝药物的研发等诸多方面发挥着日益重要的作用。但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功，故在一定程度上限制了肝细胞培养的广泛开展。制备离体肝细胞常用的方法有非酶分离细胞法、离体肝脏酶消化分离法以及在体肝脏酶灌注法。

实验步骤：

1.在玻璃培养皿中装满冰后倒置成冰台，同时取3个60mm培养皿，加入2毫升

预冷的PBS，标记上1、2、3（1号和2号培养皿需要放在冰台上使用）。

2.将麻醉过的小鼠平放在解剖台上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。在小鼠的肋骨

下沿胸骨方向剪一口，摘除小鼠的肝脏并转移到1号培养血中（注意一定不要弄破内脏，以免带来严重污染，解剖工具必须泡在75%乙醇中，用过即洗），剔除心脏上的结缔组织和血块后转入2号培养皿。

3.彻底清洗肝脏后转入3号培养皿（用注射器冲洗肝脏内部至肝脏呈灰白色）。

4.用解剖剪把肝脏切碎成1mm3大小后把含有组织块的溶液转入15毫升离心管。

5.静置静置待组织沉淀后弃上清，加入5毫升胰蛋白酶，37℃孵育5分钟后加入

几滴胎牛血清终止消化。

6.用注射器的橡胶头轻轻研磨组织块成糊状，把含有组织的溶液用200目的尼龙

筛网过滤到新的离心管中。

7.1000转离心5分钟，缓慢吸去上清，用DMEM重悬后，1000转离心5分钟，尽

量消除残留的胰酶（操作在细胞间的超净工作台中进行）。

8.加入含20%胎牛血清的完全培养基重悬沉淀后，把肝细胞铺到培养皿中，于

37℃、5%CO2条件下培养，24小时首次换液，以后每2天换液（操作在细胞间的超净工作台中进行）。

肝细胞接种培养4小时即可看到有部分细胞贴壁，24小时后细胞已基本贴壁，这时可以换液除去血细胞，3天左右培养瓶中出现成群的新生细胞集落并向周围生长。

肝细胞刚接种时有两种形状：一种体积较小胞浆颗粒较多；一种体积较大胞浆透明。两种细胞均为圆形或椭圆形，培养5天时，细胞贴壁牢固，体积明显增大，伸展生长成上皮样并相互连接融合成片。一般为了帮助细胞贴附可以在培养器皿上先涂上一层胶原或者一些促贴附成份（如Matrix等）